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1.
为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。 相似文献
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产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达 总被引：4，自引：0，他引：4
应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。 相似文献
3.
鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株（RA-YM）,根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。 相似文献
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5.
根据GenBank中禽致病性大肠杆菌pilA基因序列设计合成1对引物,以本实验室分离的禽致病性大肠杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到pilA基因片段,经测序鉴定准确后将其克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36e中,构建重组质粒并将其电转入乳酸乳球菌MG1363,得到重组乳酸乳球菌。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为19 ku,与预期相符。Western blot进一步证实了该蛋白的免疫反应性。 相似文献
6.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
7.
根据鸭疫里默氏杆菌全基因组序列,设计一对特异性引物,扩增了siderophore基因序列,克隆至pGEM-Teasy载体后进行序列测定及分析。结果表明,阅读框架全长为729bp,编码243个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析结果显示,已成功表达28ku的融合蛋白。 相似文献
8.
《中国兽医杂志》2014,(8)
以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。 相似文献
9.
为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献
10.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
11.
为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。 相似文献
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Basagoudanavar SH Goswami PP Tiwari V Pandey AK Singh N 《Veterinary research communications》2004,28(3):209-224
The full-length open reading frame coding for a potentially immunogenic 35 kDa protein of Mycobacterium avium paratuberculosis was generated using polymerase chain reaction technology. The gene was inserted in-frame into Escherichia coli expression plasmid pQE32. The resulting recombinant plasmid pPMP35 was transformed into E. coli M15. Analysis of the E. coli induced with isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside revealed that the protein accumulated into the cytoplasm as insoluble inclusion bodies. The level of expression of the recombinant 35 kDa protein (P35) was more than 30% of the total protein of E. coli cells. Expression of the recombinant protein was confirmed by immunoblotting. The P35 reacted with a rabbit antiserum raised against a sonicate of M. a. paratuberculosis. The protein was also recognized by serum from a goat with clinical paratuberculosis. Further, a polyclonal antiserum against P35 recognized a 35 kDa band in a membrane fraction of M. a. paratuberculosis. Also, the protein provoked a significant skin reaction in outbred guinea pigs sensitized with M. a. paratuberculosis, as well as in those sensitized with Mycobacterium avium. The results indicate that the 35 kDa protein of M. a. paratuberculosis is a membrane protein, having a role in the cellular immune response. 相似文献
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Zhang Zhiqiang Wu Tonglei Wu Qingmin Yan Xijun Bai Xue Zhang Yanling He Hongxuan Zhang Hongxue Liu Changhao Shi Qiumei 《畜牧与饲料科学》2018,(1)
To investigate the roles of HtrA protein in bacterial adaption to stresses, htra gene was cloned from an Escherichia coli strain isolated from silver fox, double digested, and ligated into the prokaryotic expression vector pET32a. Then, the recombinant plasmid pET32a-htra was transformed into E. coli BL21 competent cells. The over-expression of His-HtrA protein was induced by the addition of IPTG at a final concentration of 1 mmol/L, and verified by SDA-PAGE and Western blot. In addition, the protein was purified with Ni-NTA agarose, and used to immunize mice,and the polyclonal antibody specifically bound to E. coli HtrA protein. The results will provide a theoretical basis for studying the roles of HtrA protein and developing vaccines for fur-bearing animals against E. coli. 相似文献
15.
本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
16.
研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
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从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。 相似文献
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参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。 相似文献
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High milk yield, low milk fat and low milk protein were considered as possible predisposing factors to bovine Escherichia coli mastitis. Morning and afternoon milk yields were recorded in 46 Friesian cows later developing E coli mastitis and compared with 92 uninfected controls. Animals developing E coli mastitis gave a significantly higher milk yield than controls. The overall morning: afternoon ratio was (mean +/- se) 1.66 +/- 0.41, with no difference in ratio for the two groups. Further studies on 85 animals later developing E coli mastitis, and 192 controls, in four Friesian herds did not reveal differences in milk fat content (except as related to yield), milk protein or in the interrelationship of days of lactation, milk protein or in the interrelationship of days of lactation, milk fat and milk protein in the two groups. Again there was a correlation between high milk yield and a tendency to develop E coli mastitis but this may have been an age effect in both investigations. No correlation between milk yield and mastitis severity was detected. High yielders which succumbed to E coli mastitis in three herds were producing less milk than mastitis-free controls in the fourth herd which suggests that the correlation is not with yield per se. 相似文献
20.
构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。 相似文献