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1.
新城疫F48E9株L基因克隆与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验根据已知新城疫病毒L基因序列分别设计了两对引物，引物1（L1）、引物2（L2）、引物2（L2）、引物3（L3）、引物4（L4），以L1/L2为引物可以扩出4050bpF48E9株L基因的A片段（LA），以L3/L4为引物可扩增出3504bpE48E9株L基因的B片段（LB）。LA和LB2个片段经特异性双酶切后用T4DNA连接酶连接成完整的F48E9株L基因并克隆到pMD18-T载体中，对克隆后L基因5’端、3’端和连接点处的核苷酸序列进行了测定，经DNASIS软件分析表明为NDVL基因，证明我们获得了F48E9株L基因。 相似文献
2.
新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
设计了2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4，用RT-PCR法对新城疫病毒(NDV)V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约4．1kb的V4LA片段，用V4L3、V4L4扩增出约3．5kb的V4LB片段，分别对克隆出的2个片段进行序列测定，并用DNAsis软件比较分析后进行拼接，得到长约7．2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为6704bp，拥有1个6615bp的开放阅读框，推测其编码的氨基酸数为2204个。氨基酸同源性分析表明：V4克隆株与HB92 V4株L基因的同源性为99．0％，与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株)、Beaudette C、Clone30、F48E9、SF02和ZJ1株的同源性为94．1％～96．5％。 相似文献
3.
根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆 相似文献
4.
根据NDVP蛋白已知基因序列设计全盛了一对引物PU/PL，利用RT-PCR扩增出了F48E9株P基因在272bp的片段磁针 该片段克隆到pMD18-TVector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析，PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子，为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子从5’端进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株P基因片段5’端的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为83.7%，至此，我们获得了F48E9株P基因的全长克隆。 相似文献
5.
鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析 总被引：18，自引：1，他引：17
以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。 相似文献
6.
应用RT-PCR对新城疫病毒分离株毒力的快速鉴定 总被引：4，自引：3，他引：1
根据新城疫病毒 (NDV)强、弱毒株在 F蛋白裂解位点氨基酸组成和序列上的差异 ,参照有关文献 ,设计了 3对引物 (A B,A C,A D)。引物 A B能从 L a Sota、B1 、 系和强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 36 2 bp的核酸片段 ,引物 A C仅能从强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp的片段 ,引物 A D仅能从 L a Sota、B1 、 系的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp片段。 3对引物均不能从 IB、IBD、AI的含毒尿囊液和正常鸡胚尿囊液中扩增出特异片段。从发病鸡群中分离的 3株 NDV毒株均被 A C引物扩出 ,它们的鸡胚平均死亡时间 (MDT)分别为 5 1.8、5 3.2、5 2 .6 h,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 1.6 5、1.6 3、1.6 0 ,证明是 NDV强毒。利用 RT- PCR对 NDV人工感染鸡最早可于攻毒后第 2天从病鸡气管中检测到 NDV,其次为泄殖腔和脾、肾。利用 RT- PCR对 NDV毒力的鉴定结果与传统生物学试验的测定结果完全吻合 ,但前者可在 2 4 h内直接对组织匀浆进行诊断 ,具有快速、简便和敏感的特点 相似文献
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家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化 总被引：4，自引：0，他引：4
从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m g左右 相似文献
8.
根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3～ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv IBDV毒株 相似文献
9.
根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。 相似文献
10.
堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：2
根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。 相似文献
11.
新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析 总被引：16，自引：4，他引：12
采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和 相似文献
12.
新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析 总被引：12，自引：2，他引：10
本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。 相似文献
13.
新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
以提纯的我国标准ＵＤＶＦ４８Ｅ８强毒株基因组ＲＮＡ为模板、化学合成的融合蛋白（Ｆ）基因特异寡核苷酸为引物，反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ，并采用同聚物加尾的方法克隆到细菌质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）。经ＡＩＸ平板筛选和酶切分析，并用Ｆ基因片段核酸探针作ｄｏｔ－ｂｌｏｔ检测，共获得插入片段长度在０．６￣２．８ｋｂ之间的阳性克隆３４个，其中插入片段大于１．５ｋｂ的阳性克隆８个。用多种限制性内切酶对阳性克隆ｐＦ７ 相似文献
14.
15.
应用RT-PCR分别扩增出新城疫病毒(NDV)青海株(QH3)、黑龙江株(HLJ)和甘肃株(A4)的融合蛋白(F)基因的全长核苷酸,再克隆到pMD18-T载体中.经酶切和质粒PCR鉴定,获得阳性重组质粒后,进行序列测定并推导出其氨基酸序列,同时进行分析和比较.序列分析结果表明,所获得的3个分离株F基因完整的开放阅读框长度为1 662 bp,共编码F蛋白的553个氨基酸;3个毒株之间的核苷酸序列同源性为88.0%～90.6%;与常用疫苗株之间核苷酸序列同源性只有85.3%～91.6%.三者F基因的裂解位点均为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株裂解区氨基酸组成的特征.以1 bp～374 bp的核苷酸序列绘制系统发育树分析表明,QH3株NDV为基因Ⅷ型,A4株NDV为基因Ⅵ型,HLJ株NDV为基因Ⅸ型. 相似文献
16.
鸡新城疫病毒东北地区分离株融合蛋白基因的克隆与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
以 Ｎ Ｄ Ｖ 东北地区分离株 Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 的基因组 Ｒ Ｎ Ａ 为模板, 通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增其 Ｆ 基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ,并将其克隆到质粒ｐ Ｕ Ｃ１９ 中, 转化感受态大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α, 经分子量比较、酶切分析、 Ｐ Ｃ Ｒ 等鉴定方法证明, 我们分别获得了含有 Ｎ Ｄ Ｖ Ｄ Ｂ３ 、 Ｄ Ｂ５ 株 Ｆ基因的阳性重组质粒。 相似文献
17.
根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。 相似文献
18.
新城疫病毒F48E9株HN基因核苷酸序列 总被引：5，自引：0，他引：5
本研究采用 Ｓａｎｇｅｒ＇ｓ 双脱氧末端终止法测定了新城疫病毒国内标准强毒株 Ｆ４８ Ｅ９ 血凝素神经氨酸酶基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,推导出其氨基酸序列。 Ｆ４８ Ｅ９ Ｈ Ｎ 基因编码区全长为 １７１３ｂｐ,单一的开放阅读框编码５７１ 个氨基酸的糖蛋白。含有６ 个潜在的与天门冬酰胺（ Ｎ）连接的复合寡聚糖和高甘露糖寡聚糖结合位点,其中有 ５ 个簇集在蛋白分子的 Ｃ末端一半内,有１３ 个半胱氨酸残基。发现６ 个 Ｆ４８ Ｅ９ 特有的氨基酸残基,３７ 位 Ｆ（ Ｌ）、３８ 位 Ｓ（ Ａ）、６０ 位 Ｌ（ Ｐ）、１０５ 位 Ｓ（ Ｎ）、４４３ 位 Ａ（ Ｔ）、５７１ 位 Ｉ（ Ｖ）,这些位点除了 ６０ 位的 Ｐ有两株为 Ｓ以外,其它的在 １３ 株已知序列中均为高度保守序列。 相似文献
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新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）核衣壳蛋白（ＮＰ）基因序列,设计合成１对长度为３２ｍｅｒ的引物。ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＤＶＦ４８Ｅ８株、Ｕｌｓｔｅｒ株、ＬａＳｏｔａ株的ＮＰ基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均呈现１条长１．５ｋｂ左右的特异性带。将Ｆ４８Ｅ８株扩增产物克隆入ｐＵＣ１８载体,经限制性内切酶分析证实为ＮＰ基因。 相似文献