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1.
根据猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、gB基因序列,设计并合成了2对特异性引物,以PRV容A株细胞培养毒为模板,通过对PCR扩增条件的优化,建立了区分PRV野毒株和疫苗毒株的双重PCR方法。该方法能从野毒株基因组中同时扩增出2条大小分别为400bp(gE基因)、582bp(gB基因)的特异性片段,从疫苗毒DNA中仅扩增出1条大小为582bp的片段。试验证明所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,对临床上20份PRV感染疑似病料进行检测,双重PCR检测的结果与单重PCR检测结果总体符合率为100%,表明所建立的双重PCR检测方法可用于猪伪狂犬病野毒感染的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
2.
《中国兽医杂志》2016,(7)
依据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)基因序列,分别设计了g E和g H两对引物,以PRV闽A株、Bartha(g E-)株和Norden(Tk-)株为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗毒株的鉴别PCR方法。该方法能从PRV闽A株、Norden(Tk-)株中扩增出一条355 bp的条带,但Bartha(g E-)株没有扩增出该目的条带。对正常细胞、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应。在对单项PCR反应条件(引物浓度、Mg~(2+)浓度、退火温度等)优化的基础上,建立了鉴别猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的双重PCR检测方法,并分别用双重PCR和单项PCR检测15份临床病料,两者符合率为97.5%,表明该双重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。 相似文献
3.
用地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR技术从带有伪狂犬病毒（PRV）gE基因的重组质粒pMD18-T-gE中扩增回收约304bp大小的片段,并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂交,而与对照的PRVBartha-k61株疫苗毒DNA、猪细小病毒（PPV）DNA、猪圆环病毒（PCV）DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRsV）cDNA、猪瘟病毒（CSFV）cDNA的杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对PRV野毒的最低检出量为4pg。应用该探针对11份繁殖障碍病料进行了杂交检测,共检出4份阳性病料,该结果与PCR检测结果一致,表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。 相似文献
4.
《中国动物传染病学报》2016,(4)
为建立一种能够鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒与野毒套式PCR方法,根据GenBank上发表的伪狂犬病毒gD、gE基因序列,设计并合成了4对引物,对反应体系和条件进行优化,建立复合套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料中PRV检测对比等方法验证建立方法的适用性。结果表明,该方法检测的极限为2.78×10~(-4)pg/L,并且仅能从PRV野毒株扩增出354、217 bp目的条带,PRV疫苗扩增出了217bp单条带,其他5种常见感染猪的病毒均为阴性。 相似文献
5.
根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
6.
《中国动物传染病学报》2019,(1)
本研究基于猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gE基因,建立了一种PCR结合核酸斑点杂交检测方法来鉴别野毒株和疫苗株,并利用这一方法对山东省部分地区的猪临床病料中PRV进行了检测。结果显示,建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法只与PRV野毒株反应,而与PRV gE基因缺失疫苗、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒2型不反应。PCR结合核酸斑点杂交方法在53份病料中检出PRV阳性病料5份,阳性率为9.43%,高于单纯PCR的检出率(7.55%)。结果表明,本研究建立的PCR结合斑点杂交的方法特异性强,灵敏度高,适合PRV野毒的检测以及流行病学调查,可应用于PRV的鉴别诊断和净化。 相似文献
7.
猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
8.
根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2017,(2):83-88
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。 相似文献
10.
《中国兽医杂志》2016,(10)
根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗株和野毒株在ORF3基因上的差异,我们设计了一对引物用于建立PEDV疫苗株和野毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,其中疫苗株PCR扩增产物长度为213 bp,野毒株为262 bp。特异性试验结果表明,该引物对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增均为阴性。2014年3月至2015年4月期间利用该方法对河南省51家猪场的581份腹泻样本进行检测,结果发现,PEDV总阳性率为54.9%(391/581),其中野毒株阳性率84.9%(332/391),疫苗株阳性率为15.1%(59/391),说明当前腹泻样本中的PEDV检出率依然较高,且在这些PEDV阳性病料中以野毒感染为主。 相似文献
11.
参照已发表的扩增伪狂犬病毒gI和gE部分基因的PCR方法,合成了一对引物,以PRV H株细胞毒为模板,扩增出一条约850 bp的片段,并进行克隆和测序。然后与GenBank上国内外其它毒株gE基因进行核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分析,构建了遗传进化关系图。结果表明,PRV H株与其他15株PRV核苷酸和氨基酸的同源性分别为 97.0%～99.2%和93.2%～98.5%,其中与SH株最近,分别为99.2% 和98.5%;进化树分析表明,该毒株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外毒株分属不同分支,说明分离的H毒株与目前国内流行的毒株一致。 相似文献
12.
为了研究伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）立即早期180基因（immediate early 180,IE180）及其功能,试验采用设计的特异性引物通过PCR法对IE180基因进行扩增,并成功构建了IE180克隆载体,经序列测定后,用DNAStar软件对该序列和已发表的7个PRV参考株的IE180基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对分析。结果表明,HB-98株IE180基因编码区大小为4425 bp,编码1474个氨基酸,与GenBank中登录的参考株的IE180基因核苷酸同源性为98.4%～99.1%,氨基酸同源性为97.8%～98.4%。系统进化树分析结果表明,该毒株与毒株TNL(登录号：AF352564.2）的亲缘关系较近。 相似文献
13.
猪繁殖与呼吸综合征病毒GD-ZQ变异株的分离及遗传变异分析 总被引：2，自引：2，他引：0
用RT-PCR方法从某猪场病猪体内分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),命名为PRRSV GD-ZQ株,可致Marc-145细胞病变。细胞分离培育病毒至增殖性能稳定后,分别扩增分离病毒的Nsp2、ORF3、ORF5基因并测序,绘制进化树比较分析遗传进化。结果显示分离毒株的Nsp2、ORF3、ORF5基因序列与美洲型VR-2332、CH-1a等毒株核苷酸序列相似性在89.0%~95.8%之间,与欧洲毒株LV的相似性在48.2%~49.3%之间,遗传进化分析显示该毒株与CH-1a株处于同一分支,分离毒株的Nsp2序列与以HEB1为代表的PRRSV变异株相似性在98.3%~99.4%之间。该病毒在细胞盲传5代能产生稳定规律细胞病变(CPE),且第5代病毒TCID50达10-5.6／0.1 mL。进化分析结果显示GD-ZQ分离株是PRRSV变异株,具有"高热病"PRRSV毒株的变异特点,为了解PRRSV在时间上和分子水平上的遗传变异规律、变异幅度和变异范围奠定基础。 相似文献
14.
根据已发表的猪链球菌2型3-磷酸甘油醛脱氢酶(Gapc)基因保守区域设计并合成1对特异性引物,对10株不同来源链球菌Gapc基因进行PCR扩增,并选择PCR产物进行克隆并测序分析,结果在10株不同来源链球菌菌株中有8株可扩增出与预期大小(1011 bp)相一致的DNA片段;选取4株细菌PCR产物进行克隆测序,发现其片段大小为1009或1012 bp,与GenBank参考菌株Gapc基因序列的核苷酸同源性为85.3%~98.3%,氨基酸同源性为87.2%~99.4%;生物学软件分析结果显示Gapc基因在链球菌属细菌中相对保守,且具有较多的潜在抗原表位。本研究为链球菌检测技术和核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
15.
为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义. 相似文献
16.
伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解猪伪狂犬病病毒（porcine pesudorabies virus,PRV）gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。 相似文献
17.
金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌,IsdD属于金黄色葡萄球菌Isd系统中的重要成员。本研究根据GenBank报道的金黄色葡萄球菌IsdD基因序列设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增出目的片段IsdD,将其用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+)-IsdD。序列分析结果显示,目的基因序列与网上的IsdD序列相比核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98%以上。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中并成功诱导表达出大小为61.3 ku的蛋白,这为下一步研究IsdD蛋白的结构和功能奠定了良好基础。 相似文献
18.
为掌握江西省猪伪狂犬病病毒（PRV）的分子流行病学及遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2018年采集自江西南昌、宜春、赣州、吉安、九江、上饶、抚州、新余8个地区的PRV阳性猪病料进行gE和gB基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,共获得64株PRV的gE基因序列和12株PRV的gB基因序列;gE基因遗传进化树表明,64株PRV同属一个大分支,与亚洲毒株及近年来国内分离株亲缘关系较近,全部为GⅠ型,而与GⅡ型的欧美经典毒株亲缘关系较远;江西毒株gE基因与19株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%~100%和94.6%~100%;gB基因与11株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%和96.5%~100%;相较于Bartha-K61疫苗株,江西流行毒株的gB基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了江西省PRV的流行与变异情况,为江西省科学防控PRV提供理论依据。 相似文献
19.
20.
为掌握天津地区猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）的流行及遗传变异情况,本研究对2015－2020年天津地区分离的20个分离株的gB、gC和gE基因进行扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。相似性分析结果显示,分离株与2012年后中国变异株相比,3种基因核苷酸及编码氨基酸序列相似性分别为：gB基因均为99.9%~100%;gC基因为99.7%~100%和99.4%~100%;gE基因为99.7%~100%和99.6%~100%。遗传进化和序列比对分析结果显示,依据gB、gC、gE基因绘制遗传进化树均可将PRV毒株分为GⅠ型和GⅡ型,天津分离株属于GⅡ型;其中19个分离株与PRV变异株遗传关系较近,属于同一亚分支,并存在相同的氨基酸变异位点;另外1个分离株（TJBD6株）gB和gE基因与PRV变异株遗传关系较近,氨基酸变异位置与PRV变异株一致,但其gC基因与经典株Ea株遗传关系较近,且核苷酸和氨基酸序列相似性为100%。上述结果表明,2015年以来天津地区流行的PRV毒株存在经典株和变异株2种类型,其中变异株为主要流行株。本次研究初步调查了天津地区PRV分子流行特征,可为猪伪狂犬病防控提供依据。 相似文献