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1.
鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达 总被引：18，自引：0，他引：18
将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合，构建了pCAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因5′调控序列）表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明，在鸡原代输卵管上皮细胞，转染后48h表达量最高，为0．67μg/L;而在鸡成纤维细胞，不论有无类固醇激素存在，均不表达。结果提示，在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。 相似文献
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本研究旨在获得鸡胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development，EED）原核表达蛋白，并利用生物信息学方法探索其潜在生物学功能。以提取的3日龄雏鸡脾脏总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增鸡EED基因，将其克隆至pET-32a （+）载体，构建重组表达载体pET-32a-EED，转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达；Western blotting检测经镍离子亲和层析法纯化的鸡EED蛋白，并利用在线软件对其进行生物信息学分析。结果显示，鸡EED基因序列全长1 341 bp，与参考序列（GenBank登录号：NM_001031376.1）相似性为99.85％；当诱导温度为28 ℃，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂诱导表达7 h时，可在重组菌裂解上清中纯化得到分子质量约70 ku的鸡EED融合蛋白。在线软件分析表明，鸡EED蛋白相对分子质量为50 377.92，理论等电点（pI）为6.54，为亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽序列，该蛋白序列与人多疏蛋白EED三级结构模板序列（6c23.1）相似，同样具有肿瘤靶点WD40结构域。结果表明，本研究成功获得大肠杆菌表达的鸡EED可溶性蛋白，且该蛋白具有重要的功能元件，可为深入探索鸡EED蛋白的生物学功能与调控机理提供材料。 相似文献
3.
4.
根据已发表的禽脑脊髓炎病毒（AEV）1143株结构蛋白VP3基因的序列，设计1对特异性引物，经PCR从原核表达载体pET—VP3中扩增出VP3基因片段，克隆入T载体经测序证明所扩增的序列正确。从T载体切下目的片段。定向克隆入pcDNA3．1（＋）载体，转化大肠杆菌DH5u，鉴定后大量提取质粒。转染COS-1细胞，用间接免疫荧光检测到目的基因的表达。将重组载体对BALB／c小鼠进行免疫。结果2次免疫后就检测到特异性抗体，表明该载体在动物体内有较高的表达水平，可用于动物体内免疫，为进一步研究AEV的核酸疫苗打下了基础。 相似文献
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第46代鸡贫血病病毒细胞凋亡素基因的体外扩增、克隆、序列比较 总被引：6，自引：1，他引：5
通过聚合酶链式反应（PCR）扩增了第46代鸡贫血病病毒（CAV）Cux株的细胞凋亡素（Appoptin)基因，并克隆入pGEX－5X－3质粒载体中，通过限制性内切酶分析、序列测定，验证了克隆的正确性。细胞凋亡素基因全长为363bp，编码121个氨基酸。与Meehan.等发表的CAV Cux株序列相比，第46代细胞适应毒的细胞素基因的第209个核苷酸由C→T，与澳大利亚株，美国株CVA序列分别有5个和2个碱基的差别，并且均匀分布在5'端前210碱基区，而在3'端序列较为保守。与同处欧洲的英国株CAV序列相比，序列较为一致，本研究对所克隆的凋亡素编码蛋白进行了疏水性分析和抗原表位优势分析。 相似文献
6.
猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(13)
为了扩增海兰褐鸡胚胎Brachyury基因,试验采用RT-PCR的方法,根据Gen Bank中报道的原鸡Brachyury序列设计1对特异性引物,以海兰褐鸡胚胎尾芽组织提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出海兰褐鸡胚胎Brachyury的c DNA,并克隆到p MD-19T载体中,通过菌落PCR和DNA序列测定进行最终鉴定。结果表明:所克隆的c DNA为海兰褐鸡胚胎Brachyury基因的部分序列,用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果与已发表的鸡胚胎Brachyury基因序列进行对比,1 292个碱基中仅有6个碱基有差异,同时该段c DNA包含由1 167个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码387个氨基酸残基,符合Brachyury基因特征。 相似文献
8.
采用RT-PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus, IBV）HH06株E基因全长,经抗原性和亲水性分析,将E基因部分序列（193～327 bp）亚克隆于pET-32a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-32a-E1转化E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达获得大小约为23 ku的重组截短E1蛋白,Western blotting检测重组蛋白与IBV全病毒多克隆抗体能特异性反应。以纯化后的E1蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价达到220;Western blotting分析表明,E1多克隆抗体与重组表达蛋白具有良好的反应性;间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到PVAX-E1转染Hela细胞表达的E1蛋白和感染鸡胚肾细胞（CEK）中的HH06株IBV,抗E蛋白多克隆抗体的制备为E蛋白功能的深入研究奠定了基础。 相似文献
9.
根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。 相似文献
10.
本研究旨在获得鸡U6 snRNA的全序列,并对其序列、启动子及拷贝数等进行分析。本实验通过RT-PCR、克隆、测序获得了鸡U6 snRNA的部分序列(94 bp)。根据测序结果和鸡全基因组序列数据,结合生物信息学分析,结果获得了鸡U6 snRNA的全长序列(106 bp),该序列与人U6 snRNA序列相似性为100%,在鸡基因组中有4个拷贝,其中3个成簇存在于28号染色体上一段2 kb长的DNA片段上;另一个位于18号染色体。已有研究报道,这4个基因拷贝的5′侧翼区均具有启动子活性,说明它们是真基因。结果表明:这4个U6 snRNA基因启动子区均含有潜在的远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)和TATA box等RNA聚合酶Ш启动子元件。本研究成功获得了鸡U6 snRNA的全长序列,为选用U6基因作为内参基因开展鸡miRNA定量表达分析以及鸡U6基因的转录调控研究奠定基础。 相似文献
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伪狂犬病病毒冀A株TK基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了分析比较伪狂犬病病毒(PRV)冀A株TK基因与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株TK基因核苷酸及氨基酸序列的同源性,以伪狂犬病病毒冀A株的基因组为模板,PCR扩增了其胸腺激酶(TK)基因,并对其进行了克隆和测序.结果表明,TK基因的开放阅读框(ORF)和所比较的各株的核苷酸和氨基酸同源性都在99%以上.核苷酸序列中发现在起始密码子的上游有3段GC框样的序列,在终止密码子中发现多聚腺苷加尾信号AATAAA;在氨基酸序列中发现有疱疹病毒TK基因的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-. 相似文献
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西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。 相似文献
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水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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通过PCR克隆,从家蚕基因组中获得大小为975bp的DNA片段(登录号:EU352872),Blast搜寻结果显示,该片段DNA序列的52-449nt区域与野蚕mariner-like元件DNA(登录号:AB237562)的同源性达90%,推测为家蚕类mariner转座子相关序列,在乙酰胆碱酯酶基因的第5内含子、微卫星S1104-R序列、BmBRC-NZ3 mRNA终止码的下游序列、ErB·1基因的内含子均检测到家蚕类mariner元件相关序列的同源区,暗示家蚕类mariner元件在家蚕基因组中发生了多次转座,并在家蚕基因组的不同区域随着进化发生了歧化。 相似文献
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家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。 相似文献
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Sugiura K Akazawa T Fujimoto M Wijewardana V Mito K Hatoya S Taketani S Komori M Inoue N Inaba T 《Veterinary immunology and immunopathology》2008,126(3-4):388-391
To construct a vector for caspase-1 independent expression of canine IL-18, the signal sequence of canine IL-12p40 was fused to the sequence of mature IL-18 on the NdeI restriction site which is located at the 3' end of the signal sequence. The resulting vector expressed coding protein from transfected mammalian cells. The expressed protein was shown to have IL-18 bioactivity in a INF-gamma-inducing assay. These results suggest that the expression vector is the desired tool for advancement of dendritic cell (DC)-based cancer therapy, provided that the vector can successfully be transfected into dendritic cells. We propose a simple and widely applicable method for providing the signal sequence. 相似文献
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运用RT-PCR技术,克隆含信号肽和不含信号肽的小鼠分泌型白血病抑制因子cDNA,通过pMD18-T simple载体和pBS-T载体过渡,分别构建了真核表达载体pSecTag-mlif(sp )和pSecTag-mlif(sp-),酶切进行初步鉴定。利用Blast程序,搜索NCBI GeneBank中与构建表达载体中编码MLIF cDNA的同源序列,除在编码区216bp处碱基为G和在318bp处由G突变为T外,编码LIF基因的其余序列与已发表的完全一致。运用DNAMAN软件对翻译水平进行预测,结果发现这一突变位点并不影响蛋白的翻译。 相似文献
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对不同亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV) 5'LTR序列及其启动子活性进行了比较分析,以探讨LTR对ALV复制和致病力的影响。通过PCR分别扩增克隆了中国分离株GD08(ALV-A)、CD08(ALV-B)、HN06(血管瘤病变型ALV-J)和NX0101(骨髓瘤病变型ALV-J)毒株基因组5'LTR片段。与国内外不同亚群ALV分离株5'LTR核苷酸序列比较发现,NX0101株和HN06株与ALV-J国内外分离株的同源性最高,达90.8％~97.5％;GD08株与ALV-A国内分离株SDAU09C1的同源性最高,为94.6％;CD08株与GD08株和ALV-J各株的同源性高达90％以上。LTR中的R区具有较高的保守性,但CD08株U3区缺失11 bp,GD08株U5区与其它毒株的U5区差异较大。将LTR片段插入到pCAT-Basic载体的CAT报告基因前,通过转染DF-1细胞和测定CAT表达量来评价LTR的启动子活性。HN06株和NX0101株之间,以及GD08株和CD08株之间LTR启动子活性有差异,但差异不显著;而ALV-J毒株与GD08株和CD08株之间的LTR启动子活性差异显著。 相似文献
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热休克蛋白70(HSP70)广泛分布于生物体中,在蛋白转运、耐热性、细胞保护等方面起着重要作用.本研究以黑腹果蝇的一个HSP70氨基酸序列与家蚕基因组预测的基因库进行tBlastn检索,共获得了多个可能的家蚕HSP70基因,我们对编号为BGIBMGA002381进行了电子克隆.BGIBMGA002381基因的编码区序列... 相似文献