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1.
采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。 相似文献
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目的:构建稳定表达猪PBD-1的转基因细胞系,为稳定生产猪PBD-1并将其应用于新型兽药的开发提供生产细胞源。方法:真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1经酶切和测序鉴定后,用脂质体介导法转染marc-145细胞,通过不同浓度的G418加压筛选,和进一步采用单个克隆法筛选,建立稳定转染的marc-145细胞系,用RT-PCR及抑菌试验检测PBD-1的表达。结果:建立了稳定转染的marc-145细胞系,成功地表达目的基因,其培养上清液及细胞冻融液具有抑菌作用。结论:利用真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1稳定转染marc-145细胞系,为进一步研究猪PBD-1的生物学特性及其在兽用生物制品上的应用奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2014,(12)
为了探寻有效防治雏鸡感染鸡白痢沙门菌的新型防御素生物制剂,建立雏鸡感染鸡白痢沙门菌(S.Pullorum)的模型,感染324 h后检测十二指肠组织禽防御素(Av BDs)抗感染的防御性表达水平,分析Av BDs的理论等电点,选择活性强且结构稳定的Av BD,对其进行分子设计,以期构建出理论生物活性更强且结构更稳定的改型防御素。结果表明,与对照组相比,雏鸡感染鸡白痢沙门菌324 h后检测十二指肠组织禽防御素(Av BDs)抗感染的防御性表达水平,分析Av BDs的理论等电点,选择活性强且结构稳定的Av BD,对其进行分子设计,以期构建出理论生物活性更强且结构更稳定的改型防御素。结果表明,与对照组相比,雏鸡感染鸡白痢沙门菌324 h后十二指肠Av BD-6的表达水平明显上升,差异显著(P<0.05),结合理论等电点分析,选择Av BD-6做设计出发肽,用天冬氨酸替换Av BD-6原有的中性氨基酸,并在C端增加抗菌肽BF2衍生物的α螺旋,成功构建了改型防御素Av BD6-BF2,其理论生物活性与结构稳定性均强于Av BD6出发肽。本研究将为Av BDs生物制剂用于防治鸡白痢沙门菌病的可行性提供参考。 相似文献
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目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。 相似文献
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目的:构建安徽三黄鸡β-防御素2(gal-2)基因的真核表达栽体,表达gal-2蛋白.方法:提取鸡肺组织中总RNA,应用RT-PCR技术获得鸡β-防御素2(gal-2)全长eDNA基因片段,经PCR获得gal-2的成熟肽基因片段,并将其克隆入真核表达载体pPIC3.5K中,构建重组表达质粒pPIC3.5K-gal-2;经测序鉴定正确后,电转化巴斯德毕赤酵母菌GS115.经甲醇诱导表达gal-2蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:通过电转化方法成功将经酶切线性化的重组表达质粒整合入宿主菌基因组中,并在甲醇诱导的条件下成功表达出了目的蛋白.结论:成功构建了重组真核表达质粒pPIC3.5K-gal-2;并借助巴斯德毕赤酵母细胞表达出了gal-2的蛋白,其分子量大约为4.1 kDa.该研究为下一步应用基因工程和蛋白质工程技术进行gal-2蛋白的规模化生产奠定了基础. 相似文献
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本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量. 相似文献
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本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础. 相似文献
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为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。 相似文献
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旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。 相似文献
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半乳糖凝集素1(galectin-1,GAL-1)是一种分子质量约为14 ku的β-半乳糖苷结合蛋白,分布于许多不同类型的细胞和组织中,在细胞内外均具有广泛的生物学活性,参与调节多种生理病理过程。GAL-1以剂量依赖性和细胞特异性双向调控细胞增殖,通过血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)途径促进血管的生成,参与机体的免疫调节,诱导T细胞凋亡、抑制T细胞增殖和抗原递呈细胞活化等。此外,GAL-1被认为是多种类型肿瘤的标志物,肿瘤细胞通过分泌GAL-1促进肿瘤内的血管生成和自身免疫逃逸。鹿茸是指鹿科动物头部衍生的未骨化密生茸毛的幼角,也是在自然界哺乳动物中迄今为止发现的唯一可实现周期性完全再生的骨质附属器官。鹿茸的再生是基于鹿茸干细胞增殖的过程,GAL-1在鹿茸干细胞中表达,并且鹿茸的再生过程与GAL-1生物学功能息息相关。然而,GAL-1在鹿茸再生过程中所扮演的角色仍待深入研究。作者综述了GAL-1的结构、生物学功能及其在鹿茸再生过程中的作用,以期为GAL-1和鹿茸再生机制的研究带来新的启示。 相似文献
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本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列，双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞，包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞，经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化，病毒TCID50测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响，发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的... 相似文献
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防御素是一种富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,是先天免疫的重要分子。鸡体内所含的防御素一共有13种,全部属于β防御素。本实验利用RT-PCR技术扩增出来航鸡的骨髓、肝脏、肾脏中所含防御素片段,并进行测序比对,同时对鸡β防御素的蛋白质分子结构、组织分布、表达调控及其生物学功能进行了介绍。 相似文献
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重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因.经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204 bp,编码68个氨基酸残基.根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树.发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%.将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达.SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32 ku.对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定.结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性.重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250 μg/mL.此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性. 相似文献
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重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定 总被引：6，自引：1，他引：5
鸡抗菌肽属β-防御素类,在鸡的先天性免疫中发挥重要作用.本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因(AvBD10).亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10.将重组质粒转化至BL21,于37℃用IPTG诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.3%.表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约为31 ku.重组蛋白经纯化后,以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性.结果显示.重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性.此外,重组鸡AvBD10蛋白在70℃～100℃及在pH4～pH10条件下仍具有抗菌活性. 相似文献
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鸡抗菌肽属β-防御素类，在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因（AvBD10）亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21，于37℃用IPTG诱导培养不同时间，SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34．3％。表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在，分子量约为31ku。重组蛋白经纯化后，以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌，利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性。结果显示，重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性。此外，重组鸡AvBD10蛋白在-70℃～100℃及在pH4-pH10条件下仍具有抗茵活性。 相似文献
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鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性. 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(8):1260-1263
扩增鸡β-防御素-13(Gal-13)成熟肽基因序列,构建酵母重组表达载体pPICZαA-Gal-13,通过SacⅠ限制性内切酶线性化处理后,电击转化毕赤酵母X-33,并对利用甲醇诱导后的重组菌株表达产物进行表达规律分析和抑菌活性研究。结果表明,扩增到的Gal-13成熟肽基因序列为108bp,共编码36个氨基酸;筛选到的重组菌株均为Mut+表型,其诱导表达上清经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳后,发现其在约5 900的位置出现目的条带,抑菌试验发现其对沙门菌(CVCC534)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)具有抑菌活性。 相似文献