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1.
鸭β-防御素10基因的克隆、遗传进化分析及其生物学特性的初步研究 总被引：3，自引：0，他引：3
旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性.结果表明,鸭AvBD10 cDNA大小为169bp,编码55个氨基酸残基,与鸡AvBD10氨基酸同源性为85.5%.该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白的分子量约为30 ku,重组蛋白占菌体总蛋白的34%.重组鸭AvBD10蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性.结果,从鸭肝脏组织中扩增了鸭AvBD10基因,该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达.重组鸭AvBD10融合蛋白具有广谱抗菌活性,该重组蛋白对温度和酸碱度有很高的稳定性. 相似文献
2.
重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定 总被引：6，自引：1，他引：5
鸡抗菌肽属β-防御素类,在鸡的先天性免疫中发挥重要作用.本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因(AvBD10).亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10.将重组质粒转化至BL21,于37℃用IPTG诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.3%.表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约为31 ku.重组蛋白经纯化后,以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性.结果显示.重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性.此外,重组鸡AvBD10蛋白在70℃～100℃及在pH4～pH10条件下仍具有抗菌活性. 相似文献
3.
采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。 相似文献
4.
鸡抗菌肽属β-防御素类，在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因（AvBD10）亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21，于37℃用IPTG诱导培养不同时间，SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34．3％。表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在，分子量约为31ku。重组蛋白经纯化后，以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌，利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性。结果显示，重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性。此外，重组鸡AvBD10蛋白在-70℃～100℃及在pH4-pH10条件下仍具有抗茵活性。 相似文献
5.
鹌鹑β-防御素10基因的克隆与表达及其体内分布的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为测定鹌鹑β-防御素10 (AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8％).将该基因亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中进行原核表达,SDS-PAGE电泳表明,鹌鹑AvBD10重组蛋白分子量约为31ku.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性,结果显示,鹌鹑AvBD10重组蛋白具有广谱的抗菌活性.采用定量RT-PCR法检测到AvBD10在鹌鹑脏器组织中广泛表达. 相似文献
6.
为研究鹅β-防御素1(AvBD1)的生物学特性以及初步尝试探寻其抗肠炎沙门菌的作用机理,利用RT-PCR方法从鹅骨髓组织中扩增到鹅AvBD1基因片段,并将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鹅AvBD1蛋白在原核高效表达(相对分子质量约31 ku).该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性.结果显示,鹅AvBD1基因cDNA片段大小为198 bp,编码65个氨基酸残基.经相似性分析发现鹅AvBD1氨基酸序列与鸵鸟AvBD1氨基酸序列相似性最高,为77.1％,而且重组鹅AvBD1蛋白具有广谱的抗菌活性,对12种细菌(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)均具有抑菌作用.高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD1蛋白的抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低.试验表明,肠炎沙门菌确实会诱导鹅AvBD1基因在鹅骨髓组织中的表达,说明鹅AvBD1起到了抗肠炎沙门菌感染的作用,而这种作用有可能与TLR4介导的信号转导有关. 相似文献
7.
鸭β-防御素4cDNA的克隆、表达及其抑菌活性的初步分析 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在克隆与表达鸭β防御素4(AvBD4)基因及测定其生物学特性,并检测其在鸭脏器组织中的分布.采用RT-PCR方法从鸭法氏囊组织中扩增到鸭AvBD4,其cDNA大小为171 bp,编码56个氨基酸.经同源性分析,鸭AvBD4与鸡AvBD4的氨基酸序列同源性最高,达73.2％.将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD4.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃进行诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鸭AvBD4蛋白的相对分子质量约为32 ku,与预期大小一致.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性,结果显示,重组鸭AvBD4蛋白具有广谱的抗菌活性,对11种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用.在高盐离子条件下,重组鸭AvBD4蛋白仍具有抑制金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌的作用.此外,该重组蛋白的溶血活性极低.运用实时荧光定量PCR法检测到该基因在鸭组织器官中表达局限,仅在盲肠扁桃体、脾脏和法氏囊中表达. 相似文献
8.
重组Gallinacin-3的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
防御素是昆虫、植物和动物体内抗感染及激发特异性抗感染免疫的重要抗菌肽。Gallinacin-3（gal-3）可能是鸡体内最重要的β-防御素，但它的功能还未得到研究证实。本试验从鸡黏膜表皮组织中克隆了gal-3编码基因，并在大肠杆菌中成功表达了gal-3与谷胱甘肽转硫酶（GST）融合蛋白。经IPTG诱导后，融合蛋白的产量占细菌总蛋白的33．6％左右，主要以包涵体形式存在。用亲合层析技术从大肠杆菌裂解液中纯化出可溶性重组蛋白，并用酶切除目标蛋白的融合伴侣。抑菌试验发现，重组gal-3-GST融合蛋白在未去除融合伴侣时，就与游离的gal-3有着相同的抑菌活性，对沙门氏肠炎杆菌和志贺氏痢疾杆菌的最小杀菌浓度在20μg／mL（相当于约4μg／mL纯gal-3）左右，与其他物种β-防御素的活性相当。 相似文献
9.
为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。 相似文献
10.
为探讨鹅β-防御素7(Av BD7)的生物学特性,将鹅Av BD7基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体p Pro EX HTa的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒p Pro EX-Av BD7,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对其菌液进行诱导表达。经N-三(羟甲基)甲基甘氨酸十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析,该重组蛋白大小为10~15 ku,与预期大小结果一致。重组鹅Av BD7蛋白纯化后,通过菌落计数的方法测定其体外抗大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌等抑菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响及其对鸡红细胞的溶血活性。结果显示,重组鹅Av BD7蛋白对所测定的5种细菌均有显著抗菌活性(P0.05),且其抑菌活性随蛋白浓度的增加而增强。高浓度盐离子(150 mmol/L)显著抑制重组鹅Av BD7蛋白的抗菌活性(P0.05)。重组鹅Av BD7蛋白对鸡红细胞没有溶血活性(P0.05)。由此可见,重组鹅Av BD7蛋白具有广谱抗菌活性,高浓度盐离子显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白不具有溶血活性。 相似文献