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PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究 总被引：5，自引：0，他引：5
根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测 相似文献
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据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A（fibronection-binding protein A,FnbpA）基因序列,设计1对引物特异性扩增FnbpA基因A区（FnbpA-A）,然后对其进行克隆、测序、蛋白二级结构分析及抗原表位预测。结果表明,FnbpA-A基因全长1645 bp,编码548个氨基酸,与金黄色葡萄球菌CIG1835株同源性达100%;该蛋白含α螺旋13.69%、β折叠30.84%、β转角11.86%和无规则卷曲43.61%;B细胞表位可能位于N端31-46、54-69、142-157、303-318、324-339、450-465、491-506和533-548区段;T细胞表位可能位于N端353-361和245-253区段。综上所述,FnbpA-A可作为后续金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗候选基因筛选区域。 相似文献
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本试验拟探究金黄色葡萄球菌（金葡菌）表面蛋白A（Staphylococcus aureus surface protein A，SasA）编码基因在奶牛乳源金葡菌中是否具有普遍性及同源性，并结合蛋白结构组成研究SasA对奶牛乳腺上皮细胞的黏附作用。试验前期从中国北方5个荷斯坦牛场无菌条件下分离纯化了73株奶牛乳源金黄色葡萄球菌菌株，PCR扩增鉴定SasA基因并进行序列保守性分析。利用原核表达系统表达SasA蛋白的丝氨酸富集片段1（serine-rich repeat region 1， SRR1）及非重复区域（non-repeat region， NRR）并进行蛋白纯化。利用流式细胞仪检测NRR，牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）及SRR1对奶牛乳腺上皮细胞（Mac-T）黏附性差异。为进一步在NRR中定位发挥主要黏附作用的片段，试验采用了长度不同的NRR片段与完整NRR片段做竞争性黏附处理。PCR扩增产物鉴定及序列同源性分析结果显示，86.3%的牛源金葡菌菌株含SasA基因且序列一致性超过95%。相较于SRR1和BSA，NRR对细胞具有更强的黏附性。黏附抑制试验结果表明，NRR1-2片段（230—540 aa）对NRR抑制作用最明显。综上表明，SasA基因在奶牛乳源金葡菌中具有普遍性，该基因序列具有高度的保守性。在SasA蛋白中，对奶牛乳腺上皮细胞起主要黏附作用的为NRR1-2片段，大致定位在其结构域的230—540位氨基酸。本研究结果表明，与该区域结合的受体中可能存在SasA作为黏附素与奶牛乳腺上皮细胞互作的位点。 相似文献
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从3日龄健康小鸡肠道中分离到1株乳杆菌,用PCR方法从分离菌株扩增16S rRNA基因,获得大小为1340 bp的DNA片段,该片段的核酸序列已提交GenBank,登录号为EU290749。将分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上其它乳杆菌进行同源性分析并建立进化树。结果表明,分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与NCBI公布的鼠约氏乳杆菌分离株(AB295648)的同源性为99.6%,因此该分离菌株被鉴定为鸡约氏乳杆菌(chicken Lactobacillus johnsonii),命名为HN/0711。 相似文献
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为分析猪葡萄球菌脱落毒素EXHC和SHETA基因结构并预测其所编码蛋白的结构和功能,本试验根据GenBank已报道的猪葡萄球菌脱落毒素EXHC和SHETA基因序列分别设计了1对特异性引物,从猪葡萄球菌GDZC株中扩增获得EXHC和SHETA基因片段,大小分别为1007和971 bp。序列分析结果表明,EXHC基因与猪葡萄球菌丹麦分离株(GenBank登录号:AF515455)及猪源松鼠葡萄球菌河北分离株(GenBank登录号:JF755400)的核苷酸序列、氨基酸序列同源性均为100.0%,而与其他葡萄球菌脱落毒素基因的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为3.3%~53.9%和7.9%~44.2%。SHETA基因与日本分离株(GenBank登录号:AB036768)的核苷酸序列同源性为96.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,在保守区共有31个碱基发生突变。利用DNAStar软件对EXHC和SHETA蛋白结构进行分析,结果显示EXHC基因编码的蛋白为亲水性蛋白,SHETA基因编码蛋白为疏水性蛋白,抗原性较差。本研究从猪葡萄球菌GDZC株中成功扩增获得EXHC和SHETA基因片段并对其编码的蛋白结构进行了预测,证实了中国分离的猪葡萄球菌同时携带有EXHC和SHETA 2种毒素基因,为进一步研究猪葡萄球菌的致病机理及毒素之间的相互作用提供了理论依据。 相似文献
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为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
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为了解四川省副猪嗜血杆菌病的流行情况及分析分离株espp2基因,本试验从2013年8月到12月分离该菌并扩增其espp2基因进行序列分析。结果显示,分离到12株副猪嗜血杆菌,镜检发现为革兰阴性短杆菌;卫星试验表明分离株在金黄色葡萄球菌周围产生卫星现象;生化试验显示分离株发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素、D-核糖和精氨酸水解酶;PCR鉴定发现均扩增到约821bp的目的片段。药敏试验显示分离株对氟苯尼考、先锋霉素V、阿莫西林、强力霉素和环丙氟哌酸敏感。扩增SC-1和12株分离株的espp2基因并测序,测序结果与GenBank公布的副猪嗜血杆菌SH0165、ZJ0906和Nagasaki的espp2基因共计16条序列进行比对发现相似性大于98%,这16条序列编码的氨基酸序列相似性大于97%,表明副猪嗜血杆菌espp2基因变异度低,较保守。 相似文献
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试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析.结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7％～100.0％,氨基酸的同源性为94.7％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7％,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0％.M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8％～100.0％,氨基酸的同源性为94.8％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8％,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0％.4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远. 相似文献
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根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。 相似文献
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禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株. 相似文献
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为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。 相似文献
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参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株pol基因序列设计了2对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的pol基因片段,将其克隆到PMD19-T载体后测序。应用计算机软件将测定序列与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.3%,推导出的氨基酸同源性为95.0%。与外源性南非代表株JSRV-SA(M80216)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.0%,氨基酸同源性为99.3%。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒pol基因序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。 相似文献
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Molecular typing of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Korea 总被引：3，自引：0，他引：3
Lim SK Joo YS Moon JS Lee AR Nam HM Wee SH Koh HB 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2004,66(5):581-584
One hundred and sixty-six Staphylococcus aureus isolates from mastitic milk samples from different cows on 26 farms were investigated for staphylococcal enterotoxins(SEs) and toxic shock syndrome toxin-1(TSST-1) by polymerase chain reaction(PCR) and reverse passive latex agglutination assay(RPLA). SEs and the TSST-1 gene were detected in thirty-seven isolates based on a multiplex PCR; SEA was detected in 32 isolates, SEB in 3 isolates, SEC in 1 isolate, and SEA and the TSST-1 gene in 1 isolate. Of the 37 enterotoxigenic isolates, thirty-three isolates were enterotoxigenic according to RPLA, where 29 isolates produced SEA, 3 isolates produced SEB, and 1 isolate produced SEC. The enterotoxin-producing S. aureus isolates were further characterized by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE). A macrorestriction analysis revealed 11 PFGE patterns. Among the 33 enterotoxigenic S. aureus isolates, 45.4% exhibited the same PFGE pattern I. Accordingly, although the enterotoxin-producing S. aureus isolates from bovine mastitis were genetically diverse, 1 common genotype prevailed on the farms, indicating that PFGE pattern I isolates may be the most disseminated in Korea. 相似文献
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Food poisoning by Staphylococcus aureus affects hundreds of thousands of people each year. Staphylococcus aureus also causes invasive diseases such as arthritis (in poultry) and septicemia (in poultry and humans). Foodborne disease is caused by the ingestion of a staphylococcal enterotoxin (SE). Enterotoxin has also been associated with other S. aureus illnesses in humans and domestic animals. In this study, polymerase chain reaction was used to detect the staphylococcal enterotoxin genes, SEA, SEB, SEC, SED, and SEE, in S. aureus isolates associated with invasive disease in poultry and humans. In the 34 poultry isolates, only one isolate was found to contain a SE gene, sec. In the 41 human isolates, over 51% tested positive for an SE gene with 12.2% positive for the gene for SEA, 2.4% for SEB, 22% for SEC, 24.4% for SED, and 0 for SEE. The disparity between the rates for SE gene(s) in poultry and human isolates suggests a lesser role for the enterotoxins in invasive poultry disease than in human disease. 相似文献
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Milk and dairy products are frequently contaminated with enterotoxigenic Staphylococcus aureus, which is often involved in staphylococcal food poisoning. The distribution of genes encoding staphylococcal enterotoxins (SE) in S. aureus isolated from bovine, goat, sheep and buffalo milk and dairy products was verified by the presence of the corresponding SE production. A total of 112 strains of S. aureus were tested for SE production by immuno-enzymatic (SEA-SEE) and reversed passive latex agglutination (SEA-SED) methods, while multiplex-PCR was applied for SE genes (sea, sec, sed, seg, seh, sei, sej and sel). Of the total strains studied, 67% were detected to have some SE genes (se), but only 52% produced a detectable amount of the classic antigenic SE types. The bovine isolates frequently had enterotoxin SEA, SED and sej, while SEC and sel predominated in the goat and sheep strains. The results demonstrated (i) marked enterotoxigenic S. aureus strain variations, in accordance with strain origin and (ii) the two methods resulted in different information but concurred on the risk of foodstuff infection by S. aureus. 相似文献
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2011年8月,从河南省疑似传染性法氏囊病鸡群采集病料,通过鸡胚接种、琼脂扩散试验和RT-PCR等方法,证实分离的病毒为传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）,命名为HB／11株。序列分析表明,HB／11株VP2基因的核苷酸序列与GenBank中发表的部分国内外IBDV超强毒株VP2基因序列相似性在99％左右;HB／11株VP2高变区基因含有七肽基序为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。动物回归试验表明,30日龄鸡群接种该毒株后引起鸡群发病率为100％,死亡率为70％,剖检可见鸡传染性法氏囊病典型病变。因此该病毒为IBDV强毒株。 相似文献
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为了解成都市区猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫星状病毒(FAstV)和猫肠道冠状病毒(FECoV)的分子流行情况,本试验采集了315份家养猫和34份社区流浪猫的肛门拭子,含228份临床发病猫样本和121份临床健康猫样本,采用PCR方法对所有样本进行病毒核酸检测。同时,根据动物年龄、生活状态和免疫情况等因素进行病原流行分析,并根据病毒基因片段序列构建遗传进化树。结果显示,FPV、FAstV和FECoV的检出率分别为38.4%(134/349)、23.2%(81/349)和19.5%(68/349)。在混合感染方面,以FPV/FAstV(9.5%,33/349)、FAstV/FECoV(4.6%,16/349)和FPV/FECoV(4.3%,15/349)双重感染为主。基于部分基因序列的分析结果显示,样本间FPV VP2基因序列的同源性为95.1%～100%,发病猫毒株分为两个分支,其中一支与葡萄牙毒株(GenBank登录号:KT240136)和加拿大毒株(GenBank登录号:MF069445)遗传关系较近;另一支与中国的CPV毒株(GenBank登录号:KY937664)关系较近。样本间FAstV ORF1b基因序列同源性为90.9%～99.7%,发病猫的毒株的两个分支中一支与葡萄牙毒株(GenBank登录号:KF374704)和美国毒株(GenBank登录号:KM017743)关系较近;另一分支与中国香港毒株(GenBank登录号:KF499111)关系紧密。样本间FECoV的N基因序列同源性范围为89.3%～100%,与美国毒株(GenBank登录号:FJ938059)、意大利毒株(GenBank登录号:GU017092/GU017107)和中国毒株(GenBank登录号:KT852997)关系密切。调查结果表明,成都市区猫携带病毒性腹泻病原的情况较为普遍,部分猫存在多病原混合感染,且病毒基因序列存在明显变异,增加了病原流行及带毒猫发病的风险,需积极地进行临床防控。 相似文献