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1.
鸡β-防御素-1cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：8，自引：3，他引：8
从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA，经过反转录PCR（RT-PCR）扩增出鸡β-防御素-1（Gallinacin-1，Gal-1）cDNA，将扩增产物与pGEM—T Easy载体相连，经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp，与报道的Gal—1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸序列表明Gal-1与火鸡异嗜性白细胞肽-1（Turkey heterophil peptides，THP-1）具有85．4％同源性。氨基酸序列方面Gal-1与THP-1同源性最高，为72．7％。将Gal-1基因成熟肽片段插入到酵母表达载体pPIZα-C，构建重组表达载体pPICZα-C-gal-1，电转入表达宿主菌X-33，Zeocin抗性筛选重组菌株。挑取阳性菌株经甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4．5ku位置出现预期条带。对其抗菌活性检测发现具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。反相高效液相色谱表明阳性菌株表达产物与标准品在层析柱中保留时间一致。 相似文献
2.
鸡β-防御素基因的克隆、序列分析及其在组织中的分布 总被引：8，自引：1，他引：7
本研究采用RT-PCR法，分别从鸡肝脏和舌组织中扩增到鸡β-防御素（Gallinacin，Gal）Gal-6、Gal-8与Gal-9基因，经序列测定表明，Gal-6、Gal-8和Gal-9大小分别为201、204和201bp，其成熟肽分别由67、68和67个氨基酸残基组成。组织表达分析表明，Gal-6基因在鸡体内各组织器官中广泛地表达，在鸡皮肤、舌、心脏、小肠、胸肌、肝脏、肾脏、法氏囊、脾脏和胰腺中表达量较高；在肺脏、睾丸和骨髓中也有一定量表达。相比之下，Gal-8在鸡体内的表达较为局限，Gal-8基因仅在舌、小肠、肺脏和肝脏中大量表达。Gal-9基因在鸡体内组织中分布也较广泛，在舌和小肠中大量表达，在气管、肺脏、肝脏、肾脏、骨髓和胸腺有少量表达。 相似文献
3.
采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明，获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321bp，推导的Gal-4由63个氨基酸组成，其中N端20个氨基酸为信号肽，C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外，分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡（对照组）和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡（感染组）的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明，在检测的6个组织中，肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别，而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异，感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中，对照组的30个样品检测到26个阳性样品，而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中，对照组30个样品检测到19个阳性样品，而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中，Gal-4基因的诱导表达情况非常明显，对照组30个样品中仅有9个阳性，而感染组的30个样品中有21个阳性。 相似文献
4.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
5.
根据GenBank收录的猪白细胞介素-6（PIL-6）设计1对特异性引物，经刀豆蛋白素A（Co—nA）诱导猪淋巴细胞并提取总RNA，用1it—PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上，经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明：该基因cDNA全长741bp，开放阅读框由639个核苷酸组成，推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现：荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高，为99．8％。100％，氨基酸的同源性为99．5％-100％。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析，表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。 相似文献
6.
根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。 相似文献
7.
堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：2
根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。 相似文献
8.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
9.
利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。 相似文献
10.
本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 相似文献
11.
根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。 相似文献
12.
提取经植物血凝素（PHA）诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA，采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因，经PCR和酶切鉴定及测序分析，再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中，构建了原核表达重组载体，经IPTG诱导表达重组蛋白，可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白，主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明，牦牛IFN-β基因ORF为498bp，与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98．6％，与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72．5％、68．9％、66．1％和63．5％，而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25％；分子遗传进化树分析也表明，牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近，而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远，说明IFN-β基因有种属差异性。 相似文献
13.
用RT－PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区[即NS3（△C）]基因cDNA，将之克隆到pGEM T载体测定其核苷酸序列，并出其对应氨基酸序列，结果表明这两个毒株间的NS3（△C）区基因核苷酸序列同源性为95.8%，氨基酸序列同源笥为99％，有2个残基的差异；两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较，所测核苷酸序列及的氨基酸序列均极为保守，而且氨基酸序列分析结果还表明，瘟病毒NS3（△C）序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His，Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体，三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基，将上述NS3（△C）基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中，并在E.coli中获得高效表达，将表达产物纯化并免疫小鼠，间接免疫荧光和Western blot结果表明制备了针对NS3（△C）蛋白的多克隆抗体，上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用，提供了基础材料及参考数据。 相似文献
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成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。 相似文献
16.
异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是生物体内一种重要的氧化还原酶。根据已报道的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)基因的保守性序列设计引物,以柳蚕(Actias seleneHubner)蛹脂肪体cDNA为模板,经PCR扩增获得了柳蚕IDH基因的部分序列。该序列长1 269 bp,编码412个氨基酸,与家蚕IDH基因的cDNA序列同源性达82.5%。柳蚕IDH与果蝇、赤拟谷盗、斑马鱼、人、大鼠、库蚊、人体虱、恶性疟原虫IDH的氨基酸序列同源性在70%左右,具有较高的保守性。半定量PCR检测结果表明,柳蚕IDH基因在蛹期不同组织中均有表达,且表达量没有显著差异。 相似文献
17.
根据GenBank中公布的山羊Leptin基因部分基因组核苷酸序列，设计合成一对引物，以山羊脂肪组织总RNA为模板，采用RT—PCR法，扩增出Leptin成熟蛋白编码cDNA序列，将此扩增产物克隆入pMD18-T载体，进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明，扩增的山羊Leptin基因编码序列长为441bp，编码146个氨基酸。同源性分析表明，山羊Leptin基因成熟蛋白编码cDNA与小鼠、人、猪、牛及绵羊基因相应序列的同源性分别为82．22％、87．76％、92．97％、96．15％和98．64％，氨基酸同源性为84．25％、86．99％、92．47％、97．95％和100．00％，说明Leptin是一组在进化上高度保守的蛋白质。山羊Leptin成熟蛋白cDNA的成功克隆，为进一步研究黄淮山羊Leptin基因全结构、基因表达与调控奠定了基础。 相似文献
18.
鸡柔嫩艾美尔球虫ZJ株3-1E基因的原核表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验对E．tenellaZJ株的3-1E基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫3-1E基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增得到一条特异片段,将扩增产物克隆至pUCM—T,转化感受态菌DH5仅,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．5％。然后将重组质粒和表达载体pET-30a分别以EcoRⅠ、SalⅠ酶切后构建重组表达载体pET-30a-3—1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Westernblot检测显示,3-1E基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子量约为27ku,诱导6h的蛋白表达量可达到47、024％。 相似文献
19.
四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT—PCR法扩增了鸭、孔雀、榛鸡和鹧鸪的Sox8基因的部分cDNA序列并测序，计算机模拟预测了其氨基酸序列，并将所得的序列与GenBank上发表的家鸡的相应序列进行同源性比较。结果表明：5个物种的核苷酸序列同源性可达96％以上。。 相似文献
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【目的】克隆白来航鸡半乳糖凝集素-1(galectin-1,Gal-1)基因,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并检测其在不同组织中的表达情况,为进一步阐明其抗病毒功能提供科学依据。【方法】以鸡脾脏cDNA为模板,通过PCR扩增鸡Gal-1基因完整CDS区序列,并进行相似性比对及系统进化树构建;运用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、修饰结构、保守结构域及高级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR检测Gal-1基因在白来航鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、盲肠、直肠、胸肌和腿肌组织中的表达情况。【结果】白来航鸡Gal-1基因CDS区序列长度为408 bp,编码135个氨基酸。相似性比对结果表明,白来航鸡Gal-1基因核苷酸序列与火鸡、绿头鸭和珍珠鸟的相似性分别为97.1%、88.4%和82.2%;系统进化树结果表明,白来航鸡与火鸡亲缘关系最近。Gal-1蛋白分子质量为15.06 ku,理论等电点为6.57,不稳定系数为36.05,脂肪系数为74.30,平均亲水指数为-0.259。Gal-1蛋白无信号肽,不存在跨膜区;存在2个明显的... 相似文献