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1.
为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 相似文献
2.
为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。 相似文献
3.
为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×103,1.13×103,1.31×102和1.18×102<... 相似文献
4.
为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。 相似文献
5.
《中国兽医杂志》2020,(2)
猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。 相似文献
6.
为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为102、102、103、103 TCID50/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为101、102、102、102<... 相似文献
7.
通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查. 相似文献
8.
猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。 相似文献
9.
为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。 相似文献
10.
为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV (SC483株) cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中，构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07×10-1拷贝/μL～3.07×108拷贝/μL... 相似文献
11.
PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 相似文献
12.
为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。 相似文献
13.
为建立同时快速定量检测猪博卡病毒(PBoV)G1基因群和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究参照GenBank登录的PBoV的NP1基因和PEDV的M基因保守序列,设计了引物和探针,经优化反应条件后,建立了能够同时检测PBoVG1基因群和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,敏感性试验结果显示该方法对PBoV、PEDV的质粒标准品检测下限分别为21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且组内、组间变异系数均小于4%,重复性好。应用本实验建立的方法对2017年5月~2018年8月,河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测结果显示,PBoVG1阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoVG1与PEDV共感染率为10.6%(15/142),该方法优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对PBoV和PEDV的准确检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。 相似文献
14.
根据江苏省及周边地区猪场2014年出现的临床腹泻病例,对发病猪送检病料进行了猪流行性腹泻病病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(RV)这3种重要病毒进行检测,同时分析PEDV的ORF3基因序列。结果显示:建立的三重RT-PCR检测方法,检测下限可达104拷贝/μL的混合质粒,特异性好,没有扩增出其他病毒。PEDV感染率高达36.3%,TGEV与RV的感染率均不足1%,此外还存在1例PEDV与TGEV混合感染的情况。对部分PEDV阳性病料的ORF3基因进行序列分析,发现核苷酸(氨基酸)的同源性为95.9%!100%(96.9%!100%),且与疫苗毒株遗传关系较远。该结果明确了江苏及周边地区的仔猪病毒性腹泻病原,为该病的防控提供参考依据。 相似文献
15.
《中国预防兽医学报》2019,(1)
为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Ct值与标准品模板在9.47×101拷贝/μL～9.47×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.91。本实验建立的方法对PEDV、TGEV、PDCo V、PRRSV等猪常见腹泻病样品检测无扩增,表明特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法检测下限可达到9.47×101拷贝/μL;重复性试验结果显示,组内变异系数在0.82%～1.01%,组间变异系数在1.20%～1.69%,重复性较好。采用本研究建立的方法对广西和云南等地70份临床样品进行检测,结果显示除阳性对照外,临床样品均为阴性,表明该病毒尚未传播至广东以外的省份。本实验首次建立了SeACoV N基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为SeACoV快速检测和病毒感染预防提供技术手段。 相似文献
16.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。 相似文献
17.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(15)
为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)的多重实时荧光定量PCR方法,试验根据PEDV CV777株、TGEV Purdue P115株全基因序列和RV OSU毒株的VP6基因序列,设计出3对特异性引物及探针,优化反应条件,开展特异性、敏感性、重复性和验证试验。结果表明:该方法的检测最低限为1×10~2拷贝/μL的RNA标准品或1×10~(-2)TCID_(50)/mL的疫苗毒,具有较高的敏感性;变异系数均小于10%,符合统计学要求;利用本试验所建立的方法以及商品化试剂盒对20份临床样品进行检测,符合率为100%。说明本试验建立的方法特异性好,敏感性高,重复性稳定,可用于PEDV、TGEV和RV的鉴别诊断和防控。 相似文献
18.
《畜牧与兽医》2020,(11)
为建立一种同时检测猪轮状病毒(PRoV)、猪札幌病毒(PoSaV)和猪星状病毒(PAstV)的三重PCR方法,本研究参考PRoV的VP6基因、PoSaV的RdRp基因以及PAstV的ORF1基因序列分别设计特异性引物,通过特异性、敏感性、重复性试验优化反应条件,建立了快速鉴别PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR方法。试验表明,该方法能特异性扩增PRoV、PoSaV、PAstV的目的片段,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等常见猪病病毒的检测结果均为阴性,特异性良好;PRoV、PoSaV和PAstV的检测限量分别为1.38×10~2、8.33×10~2和4.40×10~3拷贝数/μL,具有较好的敏感性。利用三重PCR和单重PCR方法同时对80份规模化猪场的临床腹泻样品进行检测,结果表明,3种病毒的样品阳性率均为5.00%,2种方法的检测结果相一致。本研究成功建立了同时PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR检测方法,可用于三种病原感染的临床鉴别诊断。 相似文献
19.
《家畜生态学报》2021,42(6)
为了解河南省不同地区猪群中猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)等病毒性腹泻的感染情况,该研究采用实时荧光PCR方法对2017-2019年采自河南省10个地区51个猪场的1 052份样品进行检测与分析。结果显示:TGEV阳性率10.9%,PEDV阳性率15.4%,PoRV阳性率2.9%,不同地区间阳性率差异不显著(P0.05); 3种病毒不同月份间阳性率差异不显著(P0.05),以冬春季节较多发生;猪群腹泻多发生混合感染,TGEV/PEDV两重感染阳性率5%,TGEV/PoRV两重感染阳性率0.95%,TGEV/PEDV/PoRV三重感染阳性率0.76%。可见,河南大部分地区3种病毒性腹泻疾病均有发生,需采取措施加以防控。该调查可为猪病毒性腹泻防控提供参考。 相似文献
20.
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。 相似文献