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1.
为表达和纯化尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)cyp19a1a蛋白,本研究从尼罗罗非鱼卵巢提取总RNA,反转录获得cDNA模板后,利用设计的引物PCR扩增cyp19a1a ORF区1200 bp片段,双酶切后连接到pET-28a(+)表达载体上,经酶切验证和DNA测序鉴定,证明成功构建了pET-28a-cyp19a1a原核表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间。结果显示,在0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后,cyp19a1a重组蛋白大量表达,并以包涵体形式存在。通过Ni2+-NTA层析柱和切胶纯化,获得与预期片段大小一致的表达蛋白,并用Western blotting验证了纯化的蛋白为目的蛋白。本研究为制备cyp19a1a抗体和研究高温对cyp19a1a蛋白表达的影响提供了重要的基础。 相似文献
2.
实验进行了青鱼( Mylopharyngodon piceus ) Dazl 基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼 Dazl 基因的编码区利用重组表达引物从pCS2- MpDazl 质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a- MpDazl 重组表达载体。然后将pET-28a- MpDazl 重组质粒转化至大肠杆菌( Escherichia coli )BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和 Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a- MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。 相似文献
3.
将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。 相似文献
4.
尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果 总被引：1，自引：1，他引：0
链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。 相似文献
5.
为获得尼罗罗非鱼Siglecs like融合蛋白,开展相关Siglecs like蛋白的功能研究,深入了解罗非鱼与无乳链球菌相互作用机制。本研究利用前期构建的3个含Siglecs like ORF的克隆质粒,PCR扩增获得Siglec-1、Siglec-4b和Siglec-14 like的膜外段序列,插入真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc中,双酶切、测序鉴定后转染COS-7细胞。q PCR、Western-blot对目的蛋白的表达进行检测;亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化效率。ELISA检测融合蛋白与GBS的结合活性。测序结果显示,成功构建3个融合蛋白真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc-Siglecs like/Ex。检测结果显示,转染细胞中3个Siglecs/Ex-Fc融合蛋白在mRNA和蛋白水平都有高效表达,且过柱后的融合蛋白具有较高纯度;3个融合蛋白与罗非鱼源GBS的结合活性较对照组均有显著差异。研究表明,利用真核表达系统成功制备了具有较高纯度的尼罗罗非鱼3种Siglecs融合蛋白,且均有与GBS的结合活性。 相似文献
6.
为研究性腺型芳香化酶P450aromA(cyp19a1a基因编码)在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的作用,实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的cyp19a1a基因cDNA全长。结果显示,3种鱼cyp19a1a基因均编码517个氨基酸残基,而且编码的蛋白都包含P450aromA特有的跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol’s肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。采用RT-PCR分析cyp19a1a基因mRNA在3种不同倍性鱼类组织中的表达情况,结果显示,cyp19a1a基因主要在实验鱼的卵巢中表达,其次在精巢、脑、脾脏有少量表达。采用实时荧光定量PCR对cyp19a1a基因mRNA在不同倍性鱼卵巢中的表达进行分析,结果发现,cyp19a1a基因在不同倍性鱼的非繁殖期卵巢的表达都高于繁殖期卵巢,并且在繁殖期和非繁殖期,cyp19a1a基因在三倍体湘云鲫的表达量高于二倍体红鲫和四倍体鲫鲤。采用免疫组织化学方法对CYP19A蛋白在不同倍性鲫鲤卵巢中的定位进行分析,结果发现,CYP19A蛋白主要定位在滤泡细胞、Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上以及Ⅱ时相卵母细胞的卵浆中。研究表明,性腺型芳香化酶在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的表达存在一定的差异性,三倍体鱼cyp19a1a基因mRNA水平表达异常,推测与其不育有关联性。 相似文献
7.
根据半滑舌鳎HIF-1αcDNA序列设计特异性引物,从半滑舌鳎肝脏中扩增HIF-1d用于表达片段,连接至载体pMD18-T,分别以KpnⅠ和XholⅠ对含有目的基因的质粒和pET-30a进行酶切,连接并转化大肠杆菌BL21中,构建了半滑舌鳎HIF-1α原核蛋白表达载体.以IPTG进行诱导表达.表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,免疫接种日本大耳白兔,制备了兔抗HIF-1α多克隆抗体.Western blot检测显示该多克隆抗体具有较好的特异性,能够与HIF-1α表达宿主菌蛋白特异性结合. 相似文献
8.
LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用protein A纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600。紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础。 相似文献
9.
应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ融合蛋白能促使人乳腺癌细胞MDA231细胞增殖,表明具有生物活性。 相似文献
10.
为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/pET28a质粒,导入到E. coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 kDa的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IGF-Ⅱ重组蛋白具有体外细胞水平的生物活性。本研究结果可为认识鱼类IGF-Ⅱ生理功能及半滑舌鳎生长调控机制提供理论支撑。 相似文献
11.
LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL。鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28%,且免疫后4周的血清抗体滴度为1∶800。该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础。 相似文献
12.
《水产科学》2021,(5)
依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50) g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并进行原核表达及条件优化,最后进行复性纯化,为进一步研究该CD2-like分子在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。研究结果表明,罗非鱼CD2-like(OnCD2-like)基因(GenBank登录号:MN296489)编码区全长1110 bp,其中胞外区长558 bp。构建OnCD2-like胞外区的原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21后,成功表达OnCD2-like胞外段重组蛋白。原核表达结果显示,目的蛋白分子质量为20 ku,主要以包涵体形式存在,而该包涵体蛋白复性纯化最佳条件为:37℃下,0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h,经梯度稀释复性并纯化后可成功获得目的重组蛋白。 相似文献
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栉孔扇贝Foxl2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与检测 总被引：1，自引：0，他引：1
以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。 相似文献
14.
克隆斑马鱼原肌球蛋白的基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行鉴定。提取斑马鱼总RNA,采用RT-PCR克隆斑马鱼原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增斑马鱼原肌球蛋白基因的完整开放阅读框,连入载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组斑马鱼原肌球蛋白。重组蛋白经Ni 2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测。获得斑马鱼原肌球蛋白基因,Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的免疫活性。本研究成功克隆并表达了斑马鱼原肌球蛋白基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性。 相似文献
15.
巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用.实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将目的基因序列插入到表达载体pET-32a上,然后转化进大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白,以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体并进行Western-blotting鉴定及抑菌性检测.实验表明,融合蛋白在37℃、0.8 mmol/L IPTG,4h条件下得到高效表达;经SDSPAGE凝胶电泳和Western-blotting分析显示,所表达融合蛋白相对分子量为30 ku,与预测蛋白大小一致并与带His标签的多克隆抗体发生特异性反应.经His Bind镍柱纯化后SDSPAGE电泳检测出现单一条带,说明获得了纯度较高的MaCCL20重组蛋白.抑菌实验表明,MaCCL20重组蛋白对金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌和嗜水气单胞菌都有较强的抑菌作用. 相似文献
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淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为对象,采用体内注射植物血细胞凝集素(PHA)方式收集有丝分裂后期的鱼体头肾细胞,低渗法制片,运用激光显微分离获得尼罗罗非鱼1号染色体,分离后的单染色体通过特异性酶切和LA-PCR体外扩增,得到500~2 000 bp之间的DNA片段,并通过Southern blot和微卫星标记得到验证。扩增片段通过电泳回收、连接转化、感受态细胞培养等步骤构建尼罗罗非鱼1号染色体微克隆文库,克隆片段长度在300~600 bp之间。 相似文献
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为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。 相似文献
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为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
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为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni2+离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集最小浓度为10 μg/mL。本实验成功构建了AJ-MBL原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了17 ku AJ-MBL蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献