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1.
参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。 相似文献
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禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定 总被引：5，自引：1，他引：4
参考已发表的禽流感病毒(AIV)H7亚型血凝素(HA)基因序列设计引物，经RT-PCR扩增了AIV-H7亚型的HA1基因片段，再将该片段定向插入到原核表达载体pGEX-4T-2中，转化大肠埃希氏菌。重组表达栽体经酶切和测序鉴定后，用IPTG诱导表达。用Western-blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明，融合表达蛋白能与AIV H7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应，而与H5N1、H9N2等其他13个亚型的抗血清无交叉反应。 相似文献
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列设计合成了一对引物AI-N1/AI-N2,利用RT-PCR方法扩增AIVNS1基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,与GenBank中收录的其他分离株NS1基因进行序列比较分析,同源性达96%~99%,含有NS1基因的1个开放性阅读框(ORF)。将该基因克隆到pET-28a中构建NS1基因原核表达质粒pET/NS1,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达,所表达的蛋白质分子质量约为30kD。Western-blotting结果表明表达的NS1蛋白有良好的生物学活性,与H5N1 AIV感染鸡血清发生特异性反应,而与H5N1 AIV灭活疫苗免疫鸡血清无反应,为建立区分野毒AIV感染家禽与AIV灭活疫苗免疫家禽ELISA方法的建立提供了生物学材料。 相似文献
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析.结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B.再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1.经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21（DE3）（pLysS）感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白.用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性. 相似文献
5.
用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒（AIV）A／Duck／Zhejiang／12／00中获得NA基因，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中，将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导，经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果显示，重组蛋白得到了可溶性表达，表达的蛋白质分子质量为33ku；该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应，具有良好的免疫原性；ELISA检测结果表明，用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。 相似文献
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将鸭呼肠孤病毒小外壳dC蛋白编码基因克隆于原核表达栽体pET32a上，经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析，获得了重组质粒pET32a-σC，转化DH5a大肠埃希氏菌感受态细胞后，经SDS—PAGE和Western—blotting分析，融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应；以0．15mmol／L IPTG诱导，5h后融合蛋白σC表达量可达高峰，分子质量为50ku；融合蛋白纯化后被用作包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA，经对检测条件优化，最佳包被浓度为5μg／mL，标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与琼脂扩散抗体检测法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性。 相似文献
7.
利用RT-PCR技术扩增了一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的NS1基因,克隆到pGEM T-easy载体上,经序列测定和分析正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体pET-NS1,阳性重组质粒转化BL21感受态细胞,用1mmol/L的IPTG诱导和SDS-PAGE电泳后获得了分子质量约为51ku的NS1融合蛋白。通过Western-blotting发现NS1蛋白可与H5N1亚型AIV单因子血清反应。为建立H5N1亚型AIV野毒株和疫苗株的特异性鉴别方法奠定了基础。 相似文献
8.
应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。 相似文献
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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表述.本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础. 相似文献
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猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备 总被引：6，自引：0，他引：6
通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。 相似文献
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本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。 相似文献
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为制备抗流感病毒(AIV)聚合酶PB1-1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究采用RT-PCR技术扩增H5N1亚型AIV聚合酶PB1部分基因片段,并将其克隆至载体pET-32a,转化至BL21细菌进行重组蛋白表达.靶蛋白经Ni+柱纯化后,western blot分析证实该重组蛋白与AIV阳性血清具有良好的免疫反应性.用纯化的PB1-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆纯化后获得2株能稳定分泌抗H5亚型PB1 MAb的细胞株CGFF10和FGFCE5,2株杂交瘤细胞的细胞培养上清及腹水效价分别为103、103和106、107.2株MAb的亚类均为IgG1.实验证明:所制备的MAb能与H5N1亚型PB1-1抗原发生特异反应,具有免疫活性,从而为PB1结构及功能的深入研究奠定了基础. 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(2):51-56
为分析T1R1(味觉受体1家族Ⅰ型)、T1R3(味觉受体1家族Ⅲ型)及PepT1(Ⅰ型寡肽转运载体)基因对湖羊氨基酸吸收的影响,以6月龄的湖羊为试验材料,采用荧光定量PCR技术对湖羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的T1R1、T1R3和PepT1基因的表达量进行相对定量分析。结果表明:T1R1和T1R3基因在检测的各段组织中均有表达,而PepT1基因在结肠中不表达;其中T1R1和T1R3基因在十二指肠中表达量最高,其次是空肠,并且两者差异显著极显著(P0.01);T1R1和T1R3基因在十二指肠(P0.01)和空肠(P0.05)中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著或显著;Pep T1基因在空肠中表达量最高,其次是回肠,并且两者差异极显著(P0.01);Pep T1基因在空肠和回肠中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著(P0.01)。该结果为进一步研究T1R1、T1R3和Pep T1基因对湖羊氨基酸吸收相关功能影响奠定基础。 相似文献
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Sugi T Kato K Kobayashi K Kurokawa H Takemae H Gong H Recuenco FC Iwanaga T Horimoto T Akashi H 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2011,73(10):1377-1379
Bumped kinase inhibitors (BKIs) target analog-sensitive kinases, which the genomes of mammals rarely encode. Previously, we demonstrated that a BKI effectively suppressed the in vitro replication of Toxoplasma gondii, the causative pathogen of toxoplasmosis, by targeting T. gondii calcium-dependent protein kinase 1 (TgCDPK1) (Eukaryotic Cell, 9: 667-670). Here, we examined whether the BKI 1NM-PP1 reduced parasite replication in vivo. A high dose of 1NM-PP1, by intraperitoneal injection, just before the parasite inoculation effectively reduced the parasite load in the brains, livers, and lungs of T. gondii-infected mice, however, a low dose of 1NM-PP1 with oral administration didn't change the survival rates of infected mice. 相似文献
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通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69ku。 相似文献
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