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1.
为深入了解弓形虫微线体蛋白9(MIC9)基因功能,以弓形虫RH株总基因组为模板PCR扩增MIC9基因片段,并构建MIC9的原核表达载体,采用Western blot对其免疫反应性进行鉴定分析。结果显示:扩增出大小为903 bp的MIC9基因片段,与预期结果一致;成功构建了pMD-18T-MIC9克隆质粒和pGEX-4T-1-MIC9原核表达载体,经过双酶切及测序鉴定正确,且能够在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白的分子量为59 kDa;经免疫反应性鉴定,MIC9重组蛋白能够被弓形虫全虫抗体特异性识别,证明重组蛋白MIC9具有一定的免疫反应性。研究结果为弓形虫MIC9基因免疫功能的后续研究提供了参考。 相似文献
2.
根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用. 相似文献
3.
《贵州畜牧兽医》2015,(6)
利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(2):265-270
克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。 相似文献
5.
根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamH I和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamH I单酶切、BamH I和Sal I双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。 相似文献
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采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。 相似文献
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犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
10.
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为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础. 相似文献
12.
利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。 相似文献
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(7):1178-1182
用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。 相似文献
15.
猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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提取HEP-Flury株狂犬病病毒RNA,RT-PCR方法扩增糖蛋白G基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序鉴定和序列分析。之后双酶切下G基因,将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,经卡那霉素抗性、PCR、双酶切及测序鉴定,获得重组单G腺病毒穿梭载体pShuttle-G。应用PCR方法在G基因末端引入口蹄疫病毒2A自剪切肽序列,并克隆入T载体,同时构建含G基因的T载体,分别双酶切回收以上2片段并将他们定向亚克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1,经系列鉴定,成功构建由2A自剪切肽序列连接双G基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dG。转染以上2个表达质粒入Ad-293细胞,荧光显微镜观察到GFP的表达,斑点印迹试验结果显示G蛋白成功表达。 相似文献
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为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株。结果表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH。本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础。 相似文献
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鹅细小病毒主要结构蛋白基因的扩增、克隆与原核表达载体的构建 总被引：5，自引：0，他引：5
根据已发表的鹅细不病毒（GPV）核苷酸序列设计并合成了1对引物,对GPV主要结构蛋白VP2和VP3基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.8kb。将该片段直接与真核表达pCR3.1T载体连接,转化人感受态大肠杆菌TOP10F＇中增值。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增以及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶Sca I 和EcoR V分别酶切进行正反向鉴定,获得了3个正向插入的克隆（PVPA）和2个反向插入的克隆（PVPB）。将正向插入的克隆PVPA1与原核表达载体pET-28b（ ）分别用BamH I和Xho I双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5a中。对所获得的重组质粒分别经Sca I、EcoR V、BamH I/Xho I酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功地构建了含有GPV主要结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。 相似文献
19.
采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。 相似文献
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采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。 相似文献