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1.
为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D600 nm值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。 相似文献
2.
以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析.结果表明,在MRS培养基中加入1％甘氨酸+0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3～4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA. pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性. 相似文献
3.
选取质粒pLEM415-egfp电转化源于陕北白绒山羊瘤胃的乳酸杆菌,研究不同生长时期及电场强度对6株羊源乳酸杆菌电转化效率的影响,并优化其转化条件。在37 ℃培养条件下,培养6株羊源乳酸杆菌,当D600 nm 达到0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时,离心收集菌体,制备感受态细胞;在电阻200 Ω、电容25 uF条件下,分别采用1.5、2.0和2.5 kV 3种电场强度电击转化感受态细胞。结果表明,羊源植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳酸杆菌(Lactobacillus coryniformis)和弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)获得最高转化效率的D600 nm和电场强度分别为0.8、1.2、1.0、0.6、0.8、0.4和1.5、1.5、1.5、1.5、1.5、2.0 kV。羊源乳酸杆菌最佳转化条件的确立,为后续乳酸杆菌转基因工程菌的构建及其应用奠定了基础。 相似文献
4.
猪β-防御素-2转化酿酒酵母方法的比较分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立操作简单、高效率的猪β-防御素-2转化酿酒酵母的方法,试验比较了酿酒酵母的两种转化方法,即电转化和醋酸锂法。结果显示,两种转化方法对细胞生长状态均有严格的要求。在醋酸锂转化中,以培养10 h,D600 nm为1.051的细胞制备感受态,热激时间为60 min时,转化率为136个/μg DNA;在电转化中,以培养12 h,D600 nm为1.359的细胞制备感受态,电击电压2.5 kV时转化效率为154个/μg DNA。但综合操作效率,最终选择醋酸锂法进行酿酒酵母的转化。 相似文献
5.
为构建以木糖为选择标记的乳酸杆菌表达载体,根据GenBank登录的E.coli JM109 xylA和xylB基因序列设计引物,以E.coli JM109基因组为模板,扩增xylAB基因,与人工合成的多克隆位点序列MCS基因、去除氯霉素基因的乳酸菌载体质粒pPG2片段及以pPG2载体质粒为模板扩增的repA基因连接,电击转化于L.casei 393感受态细胞,获得以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并命名为pOXM2。为鉴定pOXM2载体表达蛋白的效果,以含猪细小病毒VP2基因的重组质粒pMD-VP2为模板,扩增VP2基因序列,与载体质粒pOXM2连接,产物电击转化L.casei393感受态细胞,获得阳性克隆子pOXM2-VP2。重组菌经诱导,并进行SDS-PAGE及western blot分析。结果表明,有约180ku重组蛋白得到了表达,而且表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白一样的免疫反应特异性。本研究结果表明已成功构建了以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并实现了外源基因的表达,为进一步研究以重组干酪乳杆菌作为口服疫苗或表达功能性蛋白奠定了基础。 相似文献
6.
为了构建重组犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增CDV F-H融合基因。将F-H融合基因亚克隆至穿梭载体p SIP409多克隆位点上,构建p SIP-F-H表达重组子,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting检测F-H融合蛋白的表达情况。结果表明,成功地扩增了CDV F-H融合基因,构建了p SIP-F-H重组表达质粒,并电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为62.96 ku的F-H融合蛋白,且该蛋白能与CDV阳性抗体反应,具有反应原性。 相似文献
7.
为在乳酸乳球菌中表达纤维二糖水解酶II(CBH II)基因,对绿色木霉(T.reesei)CBH II基因序列进行密码子优化和合成,通过PCR及T4 DNA连接酶将人工合成的序列插入到表达载体pNZ8148中,获得重组质粒pNZ8148-CBH II,重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后,将正确的重组质粒通过电击转化进入乳酸菌NZ3900感受态细胞,通过选择性抗生素氯霉素筛选阳性克隆,放大培养后使用终浓度为20 ng/mL的Nisin进行诱导表达,诱导后的菌液经SDS-PAGE鉴定,有符合预期大小的条带,说明CBH II基因在乳酸乳球菌NZ3900中表达。研究为乳酸乳球菌的改造及开发临床应用奠定基础。 相似文献
8.
《中国兽医杂志》2017,(10)
依据乳酸菌的肠道益生作用,选择产气荚膜梭菌关键致病因子α毒素/磷脂酶C为抗原,构建产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段重组植物乳杆菌,利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc重组蛋白相对分子质量分别为40 kDa。重组质粒pSIP409-plc分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明,构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌plc蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。 相似文献
9.
参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献
10.
利用不同拓扑学结构的质粒 ,分别转化 E.coli感受态细胞、转染 SK6 - 6细胞和免疫小鼠 ,比较了不同拓扑学结构质粒对转化效率、转染率和对免疫应答水平的影响。结果显示 ,超螺旋占 5 0 %比例的猪瘟病毒 E2基因表达质粒p CDSW转化 E.coli感受态细胞的效率比开环的 p CDSW高 8倍 ,超螺旋比例占 80 %的 p VAXE2 IL- 2质粒比酶切线性化质粒转化率高 2 2倍 ;以荧光蛋白基因为报告基因 ,超螺旋比例占 80 %的荧光蛋白真核表达质粒转染真核细胞的效率是线性化质粒的 12倍 ;以猪瘟病毒主要保护性抗原 E2基因表达质粒 ,分别制备成超螺旋和开环形式占优势的质粒 ,免疫昆明鼠 ,抗体检测结果显示 ,超螺旋比例高的基因疫苗免疫效果明显好于开环质粒的基因疫苗 相似文献
11.
以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。 相似文献
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电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究 总被引：12，自引：0，他引：12
本文应用质粒pEGFP Cl带有水母绿色荧光蛋白 (GFP)基因和新霉素抗性基因 (Neor)两种报告基因转染胎儿成纤维细胞 ,进行转染条件优化。首先 ,通过成活率确定转染脉冲时程和场强 ,发现有三种组合是最适的组合 ,它们分别为 :时程 5ms,场强 1.2 5～ 1.5kV/cm ;时程 15ms时 ,场强 1.0～ 1.2 5kV/cm ;时程 2 5ms时 ,场强 0 .75～ 1.0kV/cm。接着采用场强 1.2 5kV/cm ,时程 15ms ,研究转染的温度、电导介质、细胞状态、DNA用量和细胞密度对转染效率的影响 ,结果表明电导介质为Dhanks,DNA用量为 4 μg/mL ,对数期细胞密度为 1× 10 6～ 1× 10 7个 /mL ,电击前后在 4℃下各静置 10min时 ,能获得最佳转染效率。 相似文献
14.
低转染效率一直是利用基因转染技术研究柔嫩艾美耳球虫的主要屏障。为了进一步提高现有的转染效率,本研究分别利用传统的Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪和新型的NucleofectorⅠ核转仪对柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染条件进行了优化。通过对外源DNA浓度、电场强度、环境温度及NucleofectorⅠ核转仪的内置程序这些关键参数的探索,最终发现利用Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪设置电压为2000 V,电容25 μF,利用4 mm电击杯进行电转时,转染效率最高,达到3.8×10-4,此时最佳质粒浓度为50 μg/107子孢子。 相似文献
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Effects of chlorogenic acid (CGA) supplementation during in vitro maturation culture on the development and quality of porcine embryos with electroporation treatment after in vitro fertilization 
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下载免费PDF全文 Thanh‐Van Nguyen Manita Wittayarat Lanh Thi Kim Do Thanh Van Nguyen Masahiro Nii Zhao Namula Toshiki Kunihara Fuminori Tanihara Maki Hirata Takeshige Otoi 《Animal Science Journal》2018,89(8):1207-1213
Electroporation is the technique of choice to introduce an exogenous gene into embryos for transgenic animal production. Although this technique is practical and effective, embryonic damage caused by electroporation treatment remains a major problem. This study was conducted to evaluate the optimal culture system for electroporation‐treated porcine embryos by supplementation of chlorogenic acid (CGA), a potent antioxidant, during in vitro oocyte maturation. The oocytes were treated with various concentrations of CGA (0, 10, 50, and 100 μmol/L) through the duration of maturation for 44 hr. The treated oocytes were then fertilized, electroporated at 30 V/mm with five 1 msec unipolar pulses, and subsequently cultured in vitro until development into the blastocyst stage. Without electroporation, the treatment with 50 μmol/L CGA had useful effects on the maturation rate of oocytes, the total cell number, and the apoptotic nucleus indices of blastocysts. When the oocytes were electroporated after in vitro fertilization, the treatment with 50 μmol/L CGA supplementation significantly improved the rate of oocytes that developed into blastocysts and reduced the apoptotic nucleus indices (4.7% and 7.6, respectively) compared with those of the untreated group (1.4% and 13.0, respectively). These results suggested that supplementation with 50 μmol/L CGA during maturation improves porcine embryonic development and quality of electroporation‐treated embryos. 相似文献
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山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。 相似文献
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Daichi IJIRI Akito SAEGUSA Tomoko MATSUBARA Yukio KANAI Miho HIRABAYASHI 《Animal Science Journal》2012,83(6):504-509
Chicks (Gallus gallus domesticus) show considerable growth of skeletal muscle during the neonatal period. The in vivo gene transfer method is useful for studying gene function and can be employed to elucidate the molecular mechanisms of skeletal muscle growth in chicks. We evaluated the following conditions for gene transfer to the skeletal muscle of neonatal chicks by electroporation: (i) voltage; (ii) age of the chick; (iii) plasmid DNA injected amount; and (iv) duration of gene expression. The results obtained from this study indicate that the most efficient gene transfer condition was as follows: 75 µg of plasmid DNA encoding β‐galactosidase was injected into the gastrocnemius muscle of chicks at 4 days of age electroporated at 50 V/cm. In addition, peak transferred gene expression was observed from 3 days to 5 days after electroporation. Our results provide optimal electroporation conditions for elucidating the gene function related to skeletal muscle growth and development in neonatal chicks. 相似文献
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植物乳杆菌野生质粒分析及其提取方法的优化 《畜牧与饲料科学》2018,39(11):6-9
乳酸菌质粒提取研究具有很长的历史。目前已有多个有效的乳酸菌质粒提取方法被报道，其中多数以乳酸球菌为研究对象，而植物乳杆菌质粒提取有效方法报道较少。该研究以植物乳杆菌为研究对象，通过对比分析并优化已报道的乳酸菌质粒提取方法，得到了高效且适于平台期植物乳杆菌野生质粒的提取方法。通过该方法进一步分析了植物乳杆菌野生质粒数和高拷贝质粒，为后续构建植物乳杆菌表达系统所需供体质粒和受体菌株提供了重要依据。 相似文献