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1.
《中国预防兽医学报》2019,(8)
为研制以胸膜肺炎放线杆菌(APP) 4种外毒素蛋白(ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA)和外膜蛋白(OMP)为组分的亚单位疫苗,在本研究室已表达纯化的r ApxⅠA、r ApxⅡA、r OMP的基础上,本研究通过PCR扩增得到ApxⅢA、ApxⅣA基因,并分别将其克隆至表达载体p ET-32a中,测序验证后将重组质粒转化入宿主菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后获得重组蛋白r ApxⅢA和r ApxⅣA。将获得的5种蛋白(rApxⅠA、r ApxⅡA、r ApxⅢA、r ApxⅣA和r OMP)按一定比例混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠进行免疫效果测定,设灭活疫苗组(Ⅰ组)、弗氏佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅱ组)、白油佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅲ组)、灭活疫苗+白油佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅳ组)和PBS组(Ⅴ组)。Western blot结果显示,表达了重组蛋白r ApxⅢA和r ApxⅣA且具有较好的反应原性;抗体检测结果显示,加强免疫后,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组的r ApxⅠA、r ApxⅢA、r ApxⅣA和r OMP抗体水平基本一致(p0.05),均显著高于Ⅴ组和Ⅰ组(p0.05);攻毒保护试验结果显示,Ⅱ组与Ⅲ组保护率一致(p0.05),显著高于Ⅴ组(p0.05)。表明本研究中的亚单位疫苗具有一定的免疫保护效果,为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2021,(6)
为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法,在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上,设计了针对溶血外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ截短蛋白的基因扩增引物,以实验室保存的血清2型和血清5型菌株基因组DNA作为模板进行特异性基因片段扩增,分别将目的片段克隆至原核表达载体pColdI后转化入Rosetta感受态细胞,通过1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用小鼠抗6×His组氨酸单克隆抗体和猪多抗对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析。结果表明:PCR扩增产物与预期大小相符,通过酶切鉴定和测序证明成功构建了重组表达质粒pColdI-tApxⅠ、pColdI-tApxⅢ和pColdI-tApxⅣ。诱导表达的蛋白分子量分别为63、50和54 kDa,大小符合预期,可以稳定表达可溶性蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性。该试验的成功开展将为制备APP亚单位疫苗和建立配套的鉴别诊断方法奠定基础。 相似文献
3.
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的猪的一种呼吸道传染病.到目前为止,APP已经被分离鉴定出了15种血清型(1～15).15种血清型的APP能产生属于RTX毒素家族的4种Apx毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ.ApxⅠ操纵子包含有ApxⅠ C、A、B、D 4个基因;ApxⅠ毒素含有13个富含甘氨酸的重复区.ApxⅡ操纵子仅包括结构基因ApxⅡA和激活基因ApxⅡC,而无分泌基因;ApxⅡ蛋白含有8个甘氨酸的序列重复.ApxⅢ操纵子与ApxⅠ操纵子相同,具有一个完整的操纵子;ApxⅢ在N～末端有3个疏水区,在C末端部分有13个富含甘氨酸的区域.Apx毒素的致病机理为先由没有活性的前体蛋白转变为有活性的ApxA蛋白,再由有活性的ApxA蛋白侵害细胞. 相似文献
4.
5.
猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究 总被引：8，自引：2，他引：8
利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表达产物包涵体，再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌，和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫BALB／c小鼠，间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素I、Ⅱ、Ⅲ的EuSA抗体和7型菌的血凝抗体，第2次免疫2周后用5LDso的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高，用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83．3％和91．7％，从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株，初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力，为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。 相似文献
6.
为了提高猪传染性胸膜肺炎灭活苗的保护力,本研究利用基因重组技术表达了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要致病因子蛋白:rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP。设立试验Ⅰ组(灭活苗),试验Ⅱ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP),试验Ⅲ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rApxⅣ),试验Ⅳ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rApfa)和空白对照组(PBS),每组26只BALB/c小鼠,分3次免疫,每次间隔2周,每周检测血清抗体水平,在免疫后第2周、第4周和第5周,MTT法检测脾脏T细胞增殖水平及ELISA法测定IFN-γ分泌水平。在第3次免疫后的第7 d,将每组剩余20只小鼠平均分成2组,分别以APP1型菌(5×10~9 CFU)和APP7型菌(1×10~(11) CFU)进行攻毒保护试验。结果表明,向灭活苗中添加重组亚单位成份可以提高机体的细胞免疫和体液免疫水平,并能提高灭活苗的交叉保护率;试验Ⅱ组的ApxⅠ和OMP抗体水平以及细胞免疫水平均显著高于其它各组(p<0.05),对于APP1和APP7型菌的攻毒也提供了明显优于其它各组的保护结果,试验Ⅲ、Ⅳ组的细胞、体液免疫水平及保护率较试验Ⅰ组也有所提高。结果显示出ApxⅠ、OMP抗体水平和细胞免疫水平与攻毒保护率之间存在着正相关性,向灭活苗中加入重组蛋白成份可以提高疫苗的交叉保护,试验Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫,对两个血清型APP的攻击提供了很好的保护作用,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。 相似文献
7.
将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体pGEX-6P-1，并在大肠埃希氏菌中进行了表达，表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测rApxⅡA的免疫原性，分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒，所用菌株分别为同型菌株（APP7型L25—4株）和异型菌株（APP1型4074株）。结果，免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护，且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明，rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性，作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。 相似文献
8.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
9.
猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。 相似文献
10.
以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。 相似文献
11.
猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达 总被引：2，自引：1，他引：1
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。 相似文献
12.
溶血外毒素（Apx）是胸膜肺炎放线杆菌（APP）最主要的毒力因子及保护性抗原。利用PCR技术扩增APP血清5型编码APXIN一端具有保护性抗原表位的APXIA部分基因,扩增片段长度为1149bp。将其插入原核表达载体PET-32a中,转化至E．coilBL21中诱导表达。SDSPAGE分析结果表明APXIA基因能在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白的分子量约为40ku。Western-blot结果表明该融合蛋白能被APP阳性猪血清所识别,指示表达的蛋白具有良好的免疫活性,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊治及高效亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
13.
胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析 总被引：6，自引：1，他引：6
猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25—4株为研究对象，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序，并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E．coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在，包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western—blotting免疫印迹实验，结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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重组表达猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子基因:apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ、apxⅣ、apfa和omp,以重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合免疫小鼠作为试验I组,重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢr、OMPr、ApxⅣ和rApfa组合免疫小鼠作为试验Ⅱ组,PBS为对照组,分3次免疫小鼠,采用背部皮下多点注射,每次间隔2周,免疫剂量为0.2 mL/只,3免后1周分别以APP1型菌Shope 4074株(5×109cfu)和APP2型菌S1536株(5×1010cfu)进行攻毒试验。通过小鼠保护率与抗体效价的相关性研究、肺部病理变化及肺脏细菌的分布情况等指标进行综合评价。结果显示,试验Ⅰ组4种重组蛋白特异性抗体水平显著高于其他两组(P<0.05),对APP1型菌攻毒的保护率(9/10)明显高于试验Ⅱ组(5/10)和对照组(0/8),小鼠的免疫保护率与抗体效价之间存在显著正相关;且该组对APP2型菌攻毒的保护作用(无肺脏损伤)也明显优于其它两组(典型肺部损伤)。间接免疫荧光试验表明试验Ⅰ组对肺脏细菌的清除效果也明显优于其他两组。本试验揭示试验Ⅰ组对不同血清型APP攻击能够提供很好的交叉保护作用,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。 相似文献
15.
为了研制新型有效安全的牛坏死杆菌病亚单位疫苗和诊断试剂,试验利用PCR扩增技术获得了牛坏死杆菌H05菌株hly基因的全长及5个相互重叠的截短片段的核苷酸序列,并利用原核表达载体p ET-32a对hly基因的5个截短片段进行了表达和抗原性分析。结果表明:hly-2、hly-3和hly-4片段获得了成功表达,且hly-2(aa 278~567)、hly-3(aa 566~888)和hly-4(aa 887~1163)重组蛋白能够与牛坏死杆菌多克隆抗体反应。说明hly-2、hly-3和hly-4可以用于研制新型牛坏死杆菌病亚单位疫苗和诊断试剂。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
18.
胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立 总被引：4，自引：2，他引：4
根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL ISA检测方法奠定了基础 相似文献
19.
为获得牛结节性皮肤病病毒(LSDV)p32可溶性蛋白并制备其多克隆抗体,截取了LSDV的P32基因膜外区序列,并构建了重组表达质粒pColdⅠ-P32,在大肠埃希氏菌BL21(DE3) pLysS细胞中经低温诱导表达,然后用钴离子亲和层析纯化以可溶性形式表达的重组蛋白,使用纯化的p32截短蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot鉴定。结果表明,成功使用钴离子亲和层析纯化获得LSDV p32可溶性膜外区蛋白,制备的多克隆抗体可以特异性识别LSDV感染的牛组织蛋白。获得的纯度较高的LSDV p32截短蛋白和特异性良好的多克隆抗体,为建立LSDV抗原检测方法及亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒ORF2截短基因的表达纯化及动物免疫试验 总被引：1，自引：0，他引：1
在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）重组Cap蛋白,表达产物经可溶性分析表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量诱导表达重组Cap蛋白,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的免疫原性。用该纯化的重组蛋白作为亚单位疫苗,与本实验室所构建保存的pcDNA3.1-ORF2分别免疫BALB/c小鼠,对亚单位疫苗和基因疫苗做了对比试验,为进一步研制PCV2基因工程苗奠定良好的基础。 相似文献