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1.
非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2019,(8):1421-1427
以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株构建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株,针对基因缺失株的安全性和免疫保护效果进行了特性研究。结果显示,MGF和CD2v双基因缺失株(ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v)对猪安全,接种猪能够100%抵抗亲本强毒株SY18株的攻击,对照猪全部死亡;说明该毒株可作为非洲猪瘟疫苗候选株。 相似文献
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为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响，本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1 000 bp的同源臂，分别克隆至p BS-EGFP及p BSMcherry载体中，构建同源臂质粒p BS-GFP-H240R和p BS-Mcherry-MGF505-7R，采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sg RNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA (sgRNA)，并克隆至p X330载体中，构建重组质粒p X330-sg H240R和p X330-sg MGF505-7R，经测序鉴定正确后，将线性化的同源臂质粒p BS-GFP-H240R与p X330-sg H240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，再以ASFV感染，通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化，构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R；采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R；在ASFV-ΔH240R的基础上，将线性化的同源臂质粒p BS-Mcherry-M... 相似文献
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旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。 相似文献
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本研究旨在初步筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染过程中与宿主相互作用的调控基因以及毒力基因，为非洲猪瘟(African swine fever, ASF)特效药以及疫苗研发提供分子理论基础。利用GSE145954数据集和文献挖掘，分析ASFV强毒株和弱毒株感染后宿主差异表达基因；使用Metascape数据库对差异基因进行基因功能富集分析，通过交互基因检索工具(STRING)数据库建立蛋白相互作用网络，经网络拓扑结构筛选获得病毒感染宿主调控网络关键基因，随后在细胞水平筛选调控该关键基因的ASFV毒力基因。研究发现ECE1、CCL2、CTSB、SCARB2和CD14在ASFV感染单核巨噬细胞和动物全血中均明显上调，HMBS、DYNLL1、UBB、EZH2和SERPINE1则明显下调。蛋白质相互作用(PPI)分析表明，宿主UBB、CCL2、CTSB、EZH2、SERPINE1、CD14和DYNLL1为ASFV感染宿主调控网络关键基因，其中UBB占据核心地位。ASFV B119L、I215L以及MGF360-13L可抑制UBB的表达。结果提示... 相似文献
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根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。 相似文献
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前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。 相似文献
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为了解非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)编码的未知功能蛋白MGF300-1L的基本生物学特性，利用生物信息学手段分析了该蛋白的保守性、理化性质，并对其翻译后修饰、结构与功能进行预测；通过实时荧光定量PCR分析在病毒感染条件下MGF300-1L的表达特性；最后，利用MGF300-1L的真核表达质粒，通过激光共聚焦试验分析其亚细胞定位，并采用间接免疫荧光试验(IFA)分析其免疫原性。结果显示，MGF300-1L蛋白在基因Ⅱ型ASFV中高度保守，为碱性疏水膜蛋白，具有糖基化和磷酸化修饰，与G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)结构的同源性为21%;MGF300-1L为ASFV的早期基因，其编码蛋白主要定位于细胞质；IFA未检测到ASFV感染猪的阳性血清中存在针对MGF300-1L蛋白的抗体。本研究发现，MGF300-1L为ASFV高度保守的非必需早期基因，其编码蛋白具有跨膜区及糖基化、磷酸化修饰，并定位于细胞质，免疫原性较差，为进一步探究MGF300-1L蛋白在ASFV复制周期中的功能奠定了基础。 相似文献
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<正>距我国首次报道非洲猪瘟病毒(ASFV)感染病例已经一周年了,一年内该病毒几乎肆虐了国土全境,随之造成了生猪存栏量锐减、猪肉价格发生猛涨的情况。近期候选疫苗出现、非洲猪瘟弱毒疫苗专利申请成功,据报道中国有关权威部门公布的首例非洲猪瘟流行毒株(SY18)为亲本构建的多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株[1]和中国流 相似文献
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为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。 相似文献
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为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×102,1.44×102,1.51×102和1.56×102拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病... 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 相似文献
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为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具. 相似文献
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建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10-1～105 copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%～3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PR... 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为102 TCID50。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为103和101 TCID50。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。 相似文献
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旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在100~106拷贝·μL-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 相似文献
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非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价 总被引：1，自引：0，他引：1
根据非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。 相似文献
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《蚕业科学》2020,(2)
根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10~4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10~2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。 相似文献
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为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。 相似文献
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旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明：ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。 相似文献
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为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×107拷贝/μL～1.43×100拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检... 相似文献