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1.
旨在筛选并鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)相互作用的宿主蛋白。本试验通过构建猪肺酵母cDNA文库、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达和干扰试验等手段,筛选与N蛋白互作的宿主蛋白并研究其对PRRSV复制的影响。结果显示：N蛋白和核糖体蛋白S20(RPS20)在酵母细胞内发生互作,免疫共沉淀和激光共聚焦试验进一步确定N蛋白和RPS20蛋白互作并共定位于细胞质中。过表达和干扰试验证实RPS20能够影响HP-PRRSV在细胞内的增殖。本研究丰富了PRRSV与宿主因子互作的网络,为进一步研究RPS20蛋白在PRRSV感染过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
2.
本研究前期发现核内不均一性核糖核蛋白H2能够抑制流感病毒复制,为进一步探究该蛋白抑制流感病毒机制,本研究通过过表达hnRNP H2后,利用双荧光素酶报告基因试验检测hnRNP H2对流感病毒聚合酶活性的影响,利用免疫共沉淀试验检测hnRNP H2与流感病毒RNA相互作用。结果显示：过表达hnRNP H2能够显著抑制流感病毒聚合酶活性,hnRNP H2能够与流感病毒m RNA和v RNA发生相互作用。以上结果表明：hnRNP H2可能通过与流感病毒RNA结合抑制核酸出核发挥抑制流感病毒复制作用。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2016,(11)
利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。 相似文献
4.
本试验旨在研究MID2(midline 2)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)复制的调控作用。首先用PRRSV BJ-4毒株感染MARC-145细胞，通过RT-qPCR和Western blot技术分别检测MID2的mRNA转录水平和蛋白表达水平，发现PRRSV感染能够上调MID2的表达。为了进一步探究MID2对PRRSV复制的影响，本研究过表达或沉默MID2表达，再接种PRRSV,通过RT-qPCR和Western blot技术，检测PRRSV ORF7的转录水平及N蛋白的表达水平，结果显示MID2能够抑制PRRSV复制。随后将pCMV-Flag-MID2和pGL3-IFN-β-Luc真核表达质粒共转染到HEK293T细胞中，通过双荧光素酶报告基因试验检测IFN-β的启动子活性，结果表明MID2能够正调控I-IFN信号通路。最后将MID2与RIG-I的真核表达质粒共转染到HEK293T细胞中，通过Co-IP试验发现MID2和RIG-I存在相互作用，且MID2能够以剂量依赖的方... 相似文献
5.
为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域,本研究构建了RACK1截短表达重组质粒,并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞,利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。 相似文献
6.
针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL/07/SW株GP5基因设计了3个RNA干扰靶位,构建shRNA表达质粒;将转染干扰质粒6 h后的MARC-145细胞接种病毒,并通过Real-time RT-PCR、TCID50、CPE、间接免疫荧光检测(IFA)对所设计的shRNA表达质粒的干扰效果进行评价;结果表明,构建的干扰质粒可以高效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制,说明GP5基因的这3个干扰靶位可能是PRRSV复制所必需的。本试验为PRRSV复制及基因组功能研究、抗病毒药物开发和转基因动物研究奠定了基础。 相似文献
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旨在探究热休克蛋白90 β家族成员1(heat shock protein 90 beta family member 1,HSP90B1)对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制的影响。本研究通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western blot检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1 mRNA和蛋白的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术构建HSP90B1 KO细胞,计数检测敲除HSP90B1对细胞生长的影响,BVDV TC株感染HSP90B1 KO和对照组Scramble细胞后,使用qRT-PCR、免疫荧光、病毒滴度以及细胞病变效应(cytopathic effects, CPE)检测BVDV的复制情况。结果表明,qRT-PCR检测显示BVDV感染24 h时与空白组相比HSP90B1 mRNA转录水平显著升高(P<0.05),36 h后极显著升高(P<0.01),同时Western blot显... 相似文献
8.
【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)非结构蛋白7 (nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结... 相似文献
9.
Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是一种遍布于全世界的高度传染性疾病,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）。感染PRRSV后,最先在机体内进行表达的是非结构蛋白（nonstructural proteins, NSPs）,PRRSV基因组编码区经翻译后至少产生14种NSPs（NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7a、NSP7b、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12）,这些NSPs在病毒增殖、病毒毒力、免疫学特性等方面都发挥着重要作用。作者就NSPs的研究进展进行简要概述,以期为PRRS疫苗研发及技术防控奠定基础。 相似文献
11.
《中国预防兽医学报》2015,(9)
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白Nsp9为该病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp),在病毒的转录复制过程中发挥关键性作用。为筛选与Nsp9相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交方法,以PRRSV Nsp9为诱饵蛋白,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)酵母表达c DNA文库中筛选到CALM2(Calmodulin 2)基因。酵母回返验证试验和免疫共沉淀(Co-IP)试验证明CALM2基因编码的钙调蛋白(Ca M)与Nsp9特异地相互作用。激光共聚焦试验表明Ca M与Nsp9共定位于HEK293细胞胞浆内。本研究筛选到一个与Nsp9相互作用的新宿主蛋白Ca M,但该蛋白是否直接参与PRRSV的复制过程还有待进一步研究。 相似文献
12.
试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体，用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因，构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备了NSP1蛋白的多克隆抗体，间接ELISA效价达1∶105以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示，NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备，为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(3)
为了研究麦角甾醇过氧化物(ergosterol peroxide,PE)抑制PRRSV的活性,在体外用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a毒株感染Marc-145细胞,在病毒感染的同时加入不同浓度的PE,24 h后固定细胞用间接免疫荧光检测细胞内的病毒N蛋白,同时收集细胞培养上清检测病毒滴度,结果显示,PE可剂量依赖性地抑制PRRSV在细胞中复制。分别用PE预处理病毒或细胞,结果发现,病毒与PE共孵育并不会抑制病毒感染细胞活性,而PE预处理细胞则会抑制病毒在细胞中复制。表明PE通过作用于宿主细胞而抑制PRRSV在体外细胞中复制,为进一步开发利用PE提供了基础。 相似文献
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为进一步探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(Nsp7)在病毒复制过程中发挥的生物学作用,本研究在获得Nsp7可溶性重组蛋白的基础上,首先制备了抗Nsp7蛋白兔源多克隆抗体。确定抗体的免疫活性后,将其与PRRSV共同接种Marc-145细胞。孵育1h后弃掉混合物,加细胞维持液继续培养48h,应用TaqMan探针Real Time PCR方法对培养物中病毒拷贝数进行检查。结果显示,本研究制备的多克隆抗体可以和大肠杆菌表达的Nsp7α、Nsp7β重组蛋白发生特异性结合,并有效用于病毒感染Marc-145细胞后其Nsp7蛋白分布情况的原位检测;更为重要的是,与正常家兔血清相比,不同稀释倍数的抗Nsp7多克隆抗体均可对病毒的复制产生抑制作用,其中10-3倍稀释血清的抑制率可达88.4%。结果表明,Nsp7特异性抗体可有效用于PRRSV抑制试验的研究;Nsp7作为PRRSV复制酶多聚蛋白成员之一,在病毒复制过程中发挥着重要作用。 相似文献
15.
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP2)之间的差异和生物学特性,本研究根据PRRSV、S1、SY0608株NSP2基因序列保守区设计引物,通过RT-PCR扩增出两毒株的NSP2基因,克隆到pFastBacTM HTB杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体pF-SI-NSP2和pF-SY-NSP2,分别转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-S1-NSP2和rBac-SY-NSP2.在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-S1-NSP2和rAe-SY-NSP2,Westernblot和间接免疫荧光实验结果表明,本研究成功构建了表达PRRSV S1和SY0608株NSP2蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与自然感染PRRSV的猪血清均具有良好的反应原性,为进一步研究NSP2蛋白的功能及生物学和免疫学特性奠定了基础. 相似文献
16.
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为了探究宿主蛋白Hsp90AB1在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)复制过程中的功能,以RABV疫苗毒株HEP-Flury感染鼠神经瘤母细胞N2a为模型,分析Hsp90AB1对RABV复制的影响。采用RNA干扰的方式,发现Hsp90AB1基因敲降后可影响病毒基因的转录及其表达,而未影响病毒的反基因组水平以及病毒感染力,表明Hsp90AB1在转录或蛋白表达水平上影响RABV的复制。由此初步发现Hsp90AB1在RABV复制过程中的作用方式,为继续深入研究Hsp90AB1在RABV感染过程中的作用机制提供了基础数据。 相似文献
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Viperin是一种抗病毒蛋白,具有广谱的抗病毒功能。为了研究猪源抗病毒蛋白Viperin对猪瘟病毒(CSFV)的抗病毒作用及机制,通过构建细胞系过表达或通过siRNA转染抑制Viperin表达,采用荧光定量RTPCR和病毒滴度测定检测CSFV增殖水平的变化;检测培养上清和细胞中病毒含量的变化趋势,评价其对病毒释放的影响;进而通过共聚焦试验和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验检测Viperin与病毒E2蛋白的共定位与相互作用。与对照细胞相比,过表达Viperin蛋白可以显著抑制CSFV在PK-15细胞上的复制,在感染后24、48、72h,病毒基因水平和病毒滴度分别下降68.75%、83.61%、77.27%和68.75%、87.5%、80.39%。通过RNA干扰技术抑制Viperin在PK-Vi细胞中的表达后CSFV复制显著恢复(仍低于对照组)。培养上清和细胞中病毒含量均同等程度受到抑制,表明Viperin表达对病毒的释放没有影响。共聚焦试验证明Viperin蛋白与E2蛋白在细胞内存在共定位现象。免疫共沉淀试验证明Viperin蛋白与E2蛋白存在相互作用。该研究证实Viperin具有抗CSFV作用,该作用可能是通过与病毒E2蛋白相互作用实现的,这为CSFV与宿主免疫反应相互作用研究提供了理论基础。 相似文献
19.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳(N)蛋白在病毒粒子组装和释放过程中发挥重要的作用。为筛选N蛋白与宿主细胞相互作用的蛋白,本研究分离健康猪肺泡巨噬细胞(PAM),构建了PAM的酵母cDNA文库,利用酵母双杂交方法筛选其中与PRRSV N蛋白相互作用的蛋白,结果获得3个阳性克隆。经测序并利用Blast方法比对GenBank数据库,筛选得到克隆插入的cDNA均与BCCIP(BRCA2 and CDKN1A interactingprotein)基因的1 bp～396 bp核酸序列一致。经酵母回返验证试验、GST-pulldown和免疫共沉淀试验验证了N蛋白与BCCIP之间的特异性相互作用,共定位试验显示N蛋白与BCCIP共定位于细胞核和细胞浆中。本研究鉴定了新的与PRRSV N蛋白相互作用的宿主蛋白BCCIP,BCCIP是否通过与N蛋白的相互作用参与PRRSV复制还有待深入研究。 相似文献
20.
为探究在猪圆环病毒2型(PCV2)入核复制过程中发挥生物学功能的宿主核相关蛋白,本研究借助免疫沉淀技术联合蛋白质谱鉴定技术,从宿主细胞核膜提取物中筛选到了可与PCV2 Cap蛋白发生潜在互作的2个蛋白质：高迁移率族蛋白1(HMGB1)和精氨酸酶1(ARG1)。通过进一步的免疫共沉淀试验及激光共聚焦试验,证明了HMGB1、ARG1与PCV2 Cap蛋白的相互作用,且互作与Cap蛋白的核定位信号(NLS)无关。该研究为进一步探索PCV2入核复制的机制解析提供了重要信息。 相似文献