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1.
猪O型FMDV重组多表位抗原基因的克隆表达及免疫学鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】制备猪O型FMDV广谱多表位疫苗,并筛选最适合的免疫佐剂.【方法】选取O型FMDV 3个毒株VP1蛋白的优势表位,设计并合成重复串联表位基因3FoEN2,并克隆猪IgG重链恒定区基因.利用BamHⅠ,EcoRⅠ等位点将2个基因依次克隆到pProEX-HTb载体,构建重组质粒pE-IgG并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.以IPTG诱导表达得到融合蛋白pE-IgG,经SDS-PAGE电泳分析,Western-blotting鉴定.分别用5种佐剂ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠,间接ELISA方法测定抗体水平.【结果】重组蛋白以包涵体形式正确表达,大小为45kU,且能与感染O型FMDV的猪的阳性血清发生特异性免疫反应;ISA201佐剂试验组刺激机体产生的抗体水平最高.【结论】pE-IgG蛋白具有很强的免疫原性,与ISA201佐剂混合制备成的猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗可刺激动物机体产生高水平抗体,是具有良好开发前景的疫苗. 相似文献
2.
旨在研究猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,简称Mhp)纤毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白(flagellin,简称F)-霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit,简称CTB)2种重组蛋白对口蹄疫(foot-and-mouth disease,简称FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。通过体外表达获得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1 2种重组蛋白,用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)方法检测pCold-F7-CTB蛋白的生物学活性,将重组蛋白分别与口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,简称FMDV)灭活抗原、口蹄疫灭活疫苗混合制备,皮下或腹腔接种Balb/c小鼠,共免疫2次,间隔3周。分别于免疫前、免疫后21、35、49 d采血,49 d后无菌摘取脾脏。采用阻断ELISA的方法检测小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白(IgG)抗体滴度,用流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例,以评估免疫效力。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析结果表明,2种重组蛋白成功表达。用GMl(神经节苷脂)-ELISA方法验证pCold-F7-CTB的生物学活性,发现融合蛋白F7-CTB保留了与GMl的结合能力。小鼠免疫试验结果表明,经皮下注射接种后,单独口蹄疫病毒灭活抗原组没有产生明显的抗体水平,而F7-CTB免疫增强剂组比单独口蹄疫病毒灭活抗原组的IgG滴度更高。在试验中发现,当重组蛋白与口蹄疫灭活疫苗联合使用时,血清中的IgG滴度明显增高,CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果最佳。可以初步得出,免疫增强剂P97和F7-CTB具有协同作用,皮下注射可显著提高FMD的特异性IgG水平,CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值升高,显示其具有良好的应用前景。 相似文献
3.
《甘肃农业大学学报》2019,(5)
【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19~+CD27~+CD38~+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂. 相似文献
4.
【目的】研究重组鼠疫耶尔森氏菌(简称鼠疫菌)YscF蛋白的免疫原性。【方法】将含重组质粒YscF的E.coliBL21-YscF阳性克隆接种于LB液体培养基进行诱导表达;采用Ni2+亲和层析法对表达产物进行纯化;以蛋白体为佐剂吸附重组YscF蛋白,对Balb/c小鼠滴鼻免疫后,采用间接ELISA法检测血清中抗YscF的IgG和鼻、肺、小肠冲洗液中sIgA的抗体效价。【结果】重组YscF蛋白获得了高效表达,并以可溶性蛋白形式存在于上清中;滴鼻免疫小鼠后不但可以提高血清中总IgG效价,还可以诱导呼吸道分泌IgA型抗体;对腹腔注射100LD50强毒鼠疫菌攻击有一定保护效力,存活率为60%。【结论】YscF是鼠疫菌的一个有免疫原性的蛋白,能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫;重组鼠疫菌YscF抗原可以作为改进的F1+V亚单位疫苗的辅助成分。 相似文献
5.
白细胞介素-10分子佐剂增强口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫效果研究 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】研究白细胞介素-10作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）的黏膜免疫应答。【方法】利用RT-PCR技术以Balb/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,扩增出小鼠的IL-10基因,并构建真核表达质粒proVAX-IL-10, 通过鼻腔接种方式,将口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）和真核表达质粒（proVAX-IL-10）共同免疫小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位（肺脏、生殖道）sIgA滴度,免疫组织化学法检测气管、生殖道和小肠中sIgA 的表达情况,CSFE染色法检测小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平,用胞内细胞因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4+阳性T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。【结果】成功构建了proVAX-IL-10真核重组质粒,且重组质粒可以在BHK细胞中有效表达;将proVAX-IL-10与口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1共同免疫小鼠后发现,与单独接种pcD-VP1相比,加入IL-10分子佐剂后,可以诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌,极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应水平以及CD4+ T细胞中IL-4的表达量。【结论】IL-10作为分子佐剂,通过鼻腔黏膜免疫后,可以有效增强机体对口蹄疫DNA疫苗的黏膜免疫应答,对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。 相似文献
6.
【目的】利用干酪乳酸菌作为抗原传递系统来刺激机体产生黏膜免疫反应,从而研制有效的黏膜疫苗预防ETEC F41的感染。【方法】重组菌在MRS培养基中进行表达,经SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白的表达,间接免疫荧光分析及流式细胞术检测外源蛋白展示到菌体表面。将重组菌及空质粒菌株分别滴鼻接种SPF级Balb/c小鼠,采集血液样品测定小鼠产生抗F41的特异性IgG,收集小鼠肺部冲洗液、肠道冲洗液、阴道冲洗液及粪便样品测定小鼠产生抗F41的特异性sIgA,并对小鼠进行攻毒保护性试验。【结果】重组干酪乳杆菌pLA-F41/L.casei免疫小鼠能够产生明显的抗F41的sIgA和IgG抗体水平,主动免疫组保护率在85%以上,对照组则全部死亡,被动免疫组新生幼鼠的保护率达80%,对照组保护率仅为5%。【结论】细胞表面锚定ETEC F41菌毛蛋白的重组干酪乳杆菌pLA-F41/L.casei通过滴鼻途径免疫能够有效预防F41型ETEC的感染。 相似文献
7.
【目的】针对O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus,FMDV)制备特异性的单克隆抗体,为进一步研制O型口蹄疫诊断方法提供物质基础。【方法】用纯化的O型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,结合间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,建立稳定的阳性杂交瘤细胞株,并对制备的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。【结果】获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B9和5F7,抗体亚类鉴定其均为IgG1/κ类型;IFA结果显示,2株单克隆抗体仅与O型FMDV反应,不与Asia1型FMDV反应,推测其均为抗O型FMDV的型特异性单克隆抗体;Western blot结果显示,2株单克隆抗体均无特异性条带出现,表明其所针对的抗原表位均为构象型表位;相加ELISA试验表明,2B9与5F7两株单克隆抗体识别的抗原表位相近或相同;经硫氰酸盐洗脱法测定,2B9和5F7的相对亲和力指数均为1.5 mol/L;中和试验显示,2株单克隆抗体都不具有中和活性。【结论】2株单克隆抗体的获得及其生物学性质的鉴定,为O型口蹄疫诊断方法的建立提供了基础材料。 相似文献
8.
研究霍乱毒素重组B亚单位（recombinant cholera toxin Bsubunit，rCTB）为佐剂的流感抗原滴鼻免疫小鼠后，小鼠的体液免疫和局部黏膜免疫反应。三价流感病毒灭活抗原及裂解抗原按比例与rCTB配伍，滴鼻免疫小鼠，分析血清中IgG和IgM的动态变化，二免三周后，分析血清中HAI的变化，收集鼻、肺冲洗液，分析kG和slgA的变化。结果表明：全病毒组及rCTB＋裂解抗原组各项指标变化较明显，小鼠血清kG和IgM在二免三周后仍维持在较高的水平，而其他两组均呈下降趋势；全病毒组鼻、肺冲洗液IgG和sIgA抗体滴度以及血清HAI抗体滴度均高于rCTB＋全病毒组（P〈o．01），而rCTB＋裂解抗原组鼻、肺冲洗液kG和sIgA抗体滴度以及血清HAI抗体滴度明显高于裂解抗原组（P〈0．01）。研究表明：以全病毒抗原及rCTB＋裂解抗原滴鼻免疫小鼠，均可诱导小鼠产生较强的系统免疫反应和局部黏膜免疫反应。rCTB与流感裂解抗原配伍滴鼻，可提高抗原的免疫原性，增强机体的黏膜免疫应答反应。 相似文献
9.
《江苏农业学报》2016,(3)
为探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备口蹄疫亚单位疫苗的可行性,利用E.coli表达CTB-GHloop嵌合基因,用SDS-PAGE分析目的基因的表达及表达产物的可溶性,利用神经节苷脂(GM1)为抗原鉴定重组蛋白五聚体的形成。将目的蛋白浓度调整为200μg/ml,以白油佐剂乳化制备疫苗,免疫健康仔猪,免疫后利用ELISA测定特异性抗体水平,评价免疫后体液免疫反应,利用淋巴细胞增殖实验评价细胞免疫水平。结果表明嵌合基因在E.coli中获得高效表达,重组蛋白可溶,并能够形成五聚体;Western-blot结果显示重组蛋白能够与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生反应;以每头仔猪200μg免疫,试验猪产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。 相似文献
10.
[目的]构建口蹄疫DNA疫苗[方法]构建以PRV为载体的表达FMDV P1基因的质粒pIESZP1和pUTK3CP1,免疫小鼠并检测了免疫后小鼠的抗体水平.将构建的2个真核表达质粒分别转染Vero细胞,通过PCR、IFA、Western-blot等方法检测目的基因的转录和表达.将正确表达目的基因的DNA质粒肌肉接种3周龄的Balb/C小鼠,采用ELISA和SN方法检测了免疫小鼠体内的抗体水平.[结果]携带有FMDV衣壳蛋白P1基因的DNA质粒能引起小鼠产生特异性的体液免疫反应,两重组质粒诱导小鼠产生抗FMDV的抗体水平无差异.[结论]该研究为含有FMDV P1基因重组PRV以及重组病毒的动物免疫试验以评价基因工程疫苗的免疫效果奠定了基础. 相似文献
11.
[目的]探索EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律.[方法]利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG、IgGi,IgG2,IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证.[结果]经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1,IgG2,差异极显著(P <0.01),而特异性抗体IgA,IgM和IgE差异不显著(P > 0.05).[结论]证实EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答. 相似文献
12.
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 相似文献
13.
【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4） Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化，截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段， PCR扩增其基因序列，连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化，并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株，再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统，获得大小约为67 kD的 Fiber-2截短蛋白，以包涵体的形式出现，经纯化后可获得单一的特异性条带，经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、 4F6、 5A5、 6G10和10B5），其抗体分泌稳定性、特异性好，诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400，腹水抗体效价为1:320000~1:1280000，秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、 4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链； 5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系 （LMH）进行IFA检测，结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。 相似文献
14.
[目的]金黄色葡萄菌5型荚膜多糖(CP5)分别与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin、牛血清白蛋白(BSA)进行了偶联,并在小鼠模型上比较了这2种偶联疫苗所引起的体液免疫和粘膜免疫反应。[方法]以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白为载体蛋白,与CP5进行化学偶联,并在小鼠乳腺部位免疫,然后通过检测小鼠乳汁中的抗体分析其对小鼠的免疫保护作用。[结果]乳腺局部免疫后flagellin-CP5组在乳腺部位引起了sIgA为代表的粘膜免疫反应和IgG为主的体液免疫反应。CP5和鞭毛蛋白的偶联物能够诱导更高的体液免疫以及粘膜免疫反应。[结论]鞭毛蛋白具有较强的免疫佐剂作用。 相似文献
15.
【目的】克隆犬转录因子ELF4基因（cELF4）,体外表达重组cELF4蛋白（rcELF4）并制备抗该蛋白的卵黄抗体（IgY）,为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料。【方法】采用RT-PCR扩增cELF4基因,将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征。将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET28a-cELF4,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂（ISA 15AVG、 ISA 71VG、 ISA 201VG）乳化制备免疫原,通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量。构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4,转染细胞后,利用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）分析cELF4特异性IgY的免疫活性。【结果】cELF4基因（GenBank登录号MZ198105）的开放阅读框（ORF）为1992 bp,编码663个氨基酸残基。cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高 （99.3%）,而与小鼠的相似性最低 （81.5%）。结合系统进化结果发现, cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近,而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远。rcELF4蛋白分子量大小约100 kD,可刺激鸡产生相应抗体, ISA 15AVG、 ISA 71VG和ISA201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值,其中ISA 201VG组效价最高 （>128000倍）,且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳,首免后35 d达峰值,其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高,为256000倍。3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液,与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应。rcELF4蛋白定位在细胞核。【结论】 rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达,且存在翻译后修饰现象,不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响,所制备rcELF4抗体免疫活性良好,且与人ELF4蛋白存在交叉反应。 相似文献
16.
【目的】明确重组蛋白 pGEX-TPO18 的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴 RNA,根据带科其他种属绦虫 18 kD 基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR 扩增,产物克隆于 pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的 PCR 产物和质粒 pGEX-4T-1 分别用 EcoRⅠ＋XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至 E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过 PCR 方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为 pGEX-TPO18。用 IPTG 诱导表达重组质粒,收集菌体进行 SDS-PAGE 分析,用 GST 琼脂糖树脂纯化 TPO18 蛋白,进行 Western blottting 检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206 佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔,每次 50 μg/只,共免疫 3 次,末次免疫后 34 d 每只家兔感染 1 500 个虫卵,感染 58 d 后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔 7 d 采血分离血清,ELISA 法检测血清抗体水平,以 40 µg•mL-1重组蛋白包被酶标板,血清 1﹕200 稀释,检测血清样品的 OD492nm 值。【结果】TPO18 基因的 RT-PCR 扩增产物为 339 bp, 与预期大小相符;测序结果表明无碱基突变,重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18 在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为 38.6 kD 的可溶性蛋白,Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带,表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测,免疫后7 d 免疫组家兔抗体水平开始升高,第43 天达到峰值。经口感染虫卵后,免疫组抗体水平开始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206 佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为 79.13%、65.66% 和 50.43%。【结论】研究表明弗氏佐剂免疫效果较好,有望研制出抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗。 相似文献
17.
【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。 相似文献
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抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br# 总被引：4，自引：4，他引：0
【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。 相似文献
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【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。 相似文献