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1.
《中国预防兽医学报》2019,(1)
为构建一株表达狂犬病病毒(RV) G蛋白的重组犬瘟热病毒(CDV),本研究以本实验室分离的CDVSnyder Hill疫苗株为基础,在CDV P和M基因之间插入RV弱毒疫苗株ERA G蛋白基因,构建重组质粒p CI-CDV-RVG及表达CDV N、P和L蛋白的辅助质粒p CI-CDVN、p CI-CDVP和p CI-CDVL,将重组质粒和辅助质粒共转染BSR细胞,拯救获得了表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒(rCDV-RVG),将该重组病毒在Vero细胞中传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定。结果显示RV G基因能够在r CDV-RVG中稳定存在并正确表达。病毒生长动力学曲线显示,重组病毒在Vero细胞中的增殖效率与拯救的亲本病毒r CDV无显著差异(p0.05)。本研究表明CDV Snyder Hill株作为载体表达外源基因的潜力,为研制高效、安全、廉价的CDV-RV二联活载体疫苗奠定基础。 相似文献
2.
应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。 相似文献
3.
小反刍兽疫病毒N、H和F蛋白的真核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
目的构建小反刍兽疫病毒(PPRV)H、N、F、NF重组真核表达质粒并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的N、H、F基因序列并克隆到真核表达载体pIRES1neo中,最后用PCR、酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒以磷酸钙介导法转染Vero细胞,用免疫荧光方法鉴定其在细胞中的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;重组质粒经pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫病毒N、H、F蛋白基因序列完全一致,其大小分别为1575bp、1830bp和1641bp;将重组质粒感染真核细胞,经免疫荧光检测,证明所有蛋白均得到表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF,为继续进行基因免疫研究奠定了基础。 相似文献
4.
根据已发表的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株的序列设计两对引物,以犬瘟热病毒云南株感染的Vero细胞收获病毒提取的总RNA为模板,RT-PCR扩增出H基因的939 bp(H基因前段,H1)和920 bp(H基因后段,H2)片段,分别将其定向克隆于PET-28a( )中,将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)plysS,在35℃1、.0 mmol/L IPTG诱导下获得良好表达,经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白为34 ku,与预期大小一致。免疫印迹试验显示,该重组蛋白可被CDV Onderstepoort株多克隆抗体识别,表明该重组蛋白具有抗原性。 相似文献
5.
《中国兽医杂志》2020,(5)
为了建立稳定表达犬瘟热病毒基质蛋白(M)的细胞系,从犬瘟热病毒狐狸源分离毒株SD16F中扩增出M基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo的Xho I/Not I位点处。重组质粒经PCR、Xho I/Not I双酶切及测序鉴定后转染Vero-SLAM细胞,利用G418抗性压力筛选阳性细胞,并采用RT-PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定转染细胞中M蛋白的表达情况。结果表明,成功构建了重组质粒pCI-neo-M,瞬时及稳定转染Vero-SLAM细胞后,RT-PCR和IFA能够检测到M基因的转录和表达,且G418筛选后细胞与其亲本Vero-SLAM细胞生长特性基本一致,表明获得1株能稳定表达M蛋白的细胞系,命名为Vero-SLAM-M。 相似文献
6.
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路. 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2018,(23)
为了构建共表达基因Ⅱ型新城疫病毒(NDV)F、HN蛋白的mcDNA载体,试验采用融合PCR技术将合成的Ⅱ型NDV的F基因片段与HN基因片段融合并携带Flag标签,构建pUC-F-HN-Flag基因片段,然后与mcDNA载体MN512A连接构建重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag,采用菌落PCR扩增与酶切方法对重组质粒进行鉴定;利用阿拉伯糖诱导剂诱导重组质粒产生mcDNA;将重组质粒转染至HEK-293T细胞中,收集细胞总蛋白并通过Western-blot与间接免疫荧光试验检测蛋白表达情况。结果表明:通过F、HN基因片段的扩增与融合成功构建pUC-F-HN-Flag基因片段,菌落PCR扩增与酶切结果证明重组质粒连接成功,经诱导剂诱导重组质粒成功产生mcDNA,Western-blot及间接免疫荧光试验均检测到目的蛋白。说明重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag构建成功。 相似文献
8.
为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。 相似文献
9.
犬瘟热病毒核蛋白基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
应用RT-PCR技术特异扩增出犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid pro-tein,N)高度保守序列,克隆至质粒pMD18-T中获得重组质粒pMD18-T-N,测序结果证实了重组质粒的可靠性。将目的片段克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经1 mmol/L IPTG诱导,N基因融合蛋白获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析表明,表达产物的相对分子质量与预期的55 000相符。Western-blot检测表明,表达产物与CDV标准阳性血清呈阳性反应。在此基础上,初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原,从而为进一步开发犬瘟热抗体检测试剂盒以及单克隆抗体、胶体金试纸条奠定了基础。 相似文献
10.
试验旨在通过反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9疫苗株,为中国农牧区的狂犬病和包虫病的有效防控提供技术手段。本试验参照狂犬病病毒SRV9株全基因组序列,利用基因合成技术分别合成狂犬病病毒的结构蛋白N、P、L基因,以及N-P-M基因融合片段和狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因与增强型绿色荧光蛋白eGFP融合片段基因,通过载体酶切插入连接方法,依次将狂犬病病毒L基因、N-P-M基因融合片段和G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1（-）表达载体上,构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9全长cDNA。将合成的基因分别构建于pcDNA3.1（-）表达载体,经转化、质粒酶切、基因测序鉴定结果表明,狂犬病病毒N、P、L、N+P+M和G+EgM123+eGFP基因片段长度分别为1 365、1 107、6 471、3 160和3 256 bp;EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段长度为12 465 bp,各基因片段测序结果为100%。本试验成功构建了EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段和狂犬病病毒N、P、L基因的真核表达载体,为通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒及狂犬病和包虫病二联基因重组口服活疫苗的研制提供参考。 相似文献
11.
【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5'-端长末端重复序列(5'-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5'-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重 PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5'-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5'-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。 相似文献
12.
13.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状，给养牛业带来严重经济损失，新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus, RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白，反过来外源蛋白也不会阻碍病毒的复制。本研究目的是利用反向遗传操作技术构建和拯救表达BVDV结构蛋白的重组RV,以期获得一种能表达高水平BVDV E2蛋白的重组病毒。选择Ⅰ型BVDV主要优势抗原E2蛋白基因序列进行优化后合成E2基因片段，利用Overlap PCR的方法将E2基因改造为DE2片段，以RV疫苗毒株LBNSE为病毒载体，利用BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点，将DE2基因插入LBNSE基因组中，成功构建pRV-DE2重组质粒。脂质体法将全长重组质粒转染BSR细胞后，拯救重组病毒RV-DE2,并用直接免疫荧光和RT-PCR的方法对其鉴定，对构建成功的病毒进行生长特性、致病性、重组蛋白表达特性等生物学特性和小鼠体内免疫效力的研究。结果表明，RV-DE2病毒滴度在F3代之后趋于稳定，在相同的培养条件下比亲本LBNSE病毒滴度高。重组病毒对小... 相似文献
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探讨电穿孔转染法对SRV9Ψ区缺失株重组病毒的拯救及鉴定。利用电穿孔细胞转染法,将纯化的Ψ区缺失株pcDNA-NPMG-L全长质粒和pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L辅助表达质粒共转染至BHK-21细胞中,并进行盲传,借助RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western-blot及透射电子显微镜对重组病毒进行鉴定。结果显示,重组病毒能够产生绿色荧光,透射电子显微镜观察可见典型的弹状病毒,对重组毒株与亲本毒株G蛋白进行Western-blot验证,可获得相应目的条带。结果表明,通过电穿孔细胞转染法,能成功拯救出重组病毒SRV9Ψ区缺失株,为病毒的拯救提供新的转染方法,并能有效提高转染效率,为研发新型狂犬病疫苗提供参考。 相似文献
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采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础. 相似文献
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鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
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为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AH5AIL6)的遗传稳定性,本研究将其接种CEF,绘制生长曲线.结果显示,该重组病毒与亲本病毒的生长速度及蚀斑大小一致;在CEF 连续培养20代,取第0代、5代、10代、20代重组病毒PCR扩增HA和Ⅱ-6基因进行鉴定,显示HA基因无核苷酸突变,IL-6基因在第20代时有1个氨基酸发生突变,但不影响该蛋白的功能区;间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能够表达HA蛋白,RT-PCR试验表明各代次病毒均可以表达鸡IL-6基因;通过蓝斑鉴定重组病毒纯度,结果显示所有蚀斑均为蓝斑.因此,该重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,符合兽医生物制品的生产要求. 相似文献