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应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。 相似文献
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根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。 相似文献
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旋毛虫新生幼虫期特异性T314全长cDNA的克隆及表达 总被引：4，自引：1，他引：3
利用PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长T314cDNA的信号肽祛作后重组到原核表达载体pET-28a。将重组质粒pET28-T314转入克隆菌DH5a和表达菌DE3，分别提取质粒进行酶切，测序鉴定。用KIPTG诱导培养重组表达菌DE3，做菌体裂解物外源表达产物的SDS－PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清，采用Western blot检测T314cDNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示：外源T314cDNA的PCR产物在重组质粒pET28-T314中阅读框架正确；SDS－PAGE分析结果显示：经IPTG诱导后转化菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了1条相对分子质量约为39000的新条带，大小与外源cDNA融合蛋白的理论推导值38800相符；Western blot检测结果显示：T314cDNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫，不存在于成虫与肌幼虫，且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。 相似文献
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柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。 相似文献
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应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。 相似文献
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鹿茸尖端组织核心蛋白多糖基因全长cDNA的克隆及其表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步了解鹿源DCN基因的结构与功能,揭示该基因在鹿茸尖端不同组织层的表达规律,本研究从梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA文库中首次克隆具有完整编码区的DCN基因全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列结构和表达特征进行分析.结果表明,梅花鹿DCN基因cDNA全长为1 831 bp,编码360个氨基酸;其编码蛋白具有N端信号肽,相对分子质量为39.9 ku,理论等电点为8.8,其一级结构中亮氨酸所占比例最高(12.5%);梅花鹿与绵羊DCN氨基酸序列的相似性最高(98%).实时荧光定量RT-PCR分析表明,DCN在间充质层的表达显著高于其他3层组织,提示DCN的抗纤维化活性可能是维持鹿茸间充质层快速生长的重要调节因素. 相似文献
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为了克隆五指山小型猪程序性死亡因子10(PDCD10)cDNA基因并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法,克隆得到PDCD10全长cDNA序列,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:经比对分析发现,五指山小型猪PDCD10基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、牛、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼、黑腹果蝇等具有较高的相似性。生物信息学分析结果表明,该cDNA序列全长1 250 bp,在序列3’末端有终止信号AATAAA。含636 bp(184～819 nt)的开放阅读框,编码212个氨基酸。该蛋白理论等电点(PI)及分子质量分别为7.80和24 701.57 u。 相似文献
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旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T54克隆作为核酸探针，对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选，获得1个全长1464bp的cDNA分子，该cDNA含有1个1290bp的开放阅读框架（ORF），Blastn同源性分析表明，与其它已知生物基因序列无明显的同源性，为一新的cDNA。该ORF编码1个429个氨基酸残基组成的多肽，其分子质量理论推导值为49．9ku，等电点为5．6，在12－14及103－105氨基酸残基处分别有2个糖基化位点NLS及NVS，在C末端344－409氨基酸残基处有1个FYVE锌指结构域（Profile PS50178)。Blastp同源性分析表明，与广东管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis)66.0ku蛋白（gi/1743430)同源性最高，为39．0％。在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达，表达蛋白占菌体蛋白的24％。 相似文献
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为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。 相似文献
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旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析 总被引：6，自引：4，他引：2
利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。 相似文献
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Cloning and analysis of a novel cDNA from Trichinella spiralis encoding a protein with an FYVE zinc finger domain 总被引：2，自引：0，他引：2
Fu BQ Liu MY Kapel CM Meng XP Lu Q Wu XP Chen QJ Boireau P 《Veterinary parasitology》2005,132(1-2):27-30
A cDNA library from Trichinella spiralis adults 3 days post-infection was screened with a cDNA probe, designated T 54, derived from a newborn larvae subtracted cDNA library. Sequence analysis showed that the positive clone contained a cDNA insert of 1464 bp in length with a single open reading frame of 1290 bp, which encoded a protein of 429 amino acids with a putative molecular mass of 49.9 k Da. Database analysis predicted the deduced protein had a leucine zipper motif and an FYVE zinc finger domain. The recombinant fusion protein was expressed and rabbit anti-recombinant protein sera reacted with a single peptide migrating at approximately 55 k Da in crude worm extract from muscle larvae, adults and newborn larvae stages. 相似文献
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Fu BQ Liu MY Kapel CM Meng XP Lu Q Wu XP Chen QJ Boireau P 《Veterinary parasitology》2005,132(1-2):31-35
A 5-day-old adult stage-specific cDNA fragment from Trichinella spiralis was identified by suppression subtractive hybridization and was used as a probe to screen the cDNA library. The cDNA sequence coding for a putative T. spiralis cuticle collagen was isolated. The cDNA encoded an open reading frame of 343 amino acid residues with molecular weight of 35.1 k Da. The deduced protein contained an N-terminal signal peptide, a nematode cuticle collagen N-terminal domain and a collagen triple helix repeat domain. Searches in GenBank using BLASTP showed up to 47% identity to cuticle collagens from other nematodes. Southern blot analysis of genomic DNA indicated this gene was present as a single copy in T. spiralis genome. 相似文献
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参考大鼠EGFR基因序列,用RT-PCR方法对SD大鼠EGFR基因cDNA序列进行克隆,获得了SD大鼠EGFR基因的全长4127bp的cDNA序列（GenBank登录号HM801042）,其中CDS长度为3627bp,编码1209个氨基酸。SD大鼠与国外报道的大鼠、小鼠、牛、猴、人等5个物种的EGFR基因cDNA序列的同源性分别为99．5％、92．9％、78．4％、83．4％、80．2％,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为99．6％、95．9％、86．6％、89．0％、90．5％。这一结果表明了EGFR基N在进化过程中具有较高的保守性。通过比较SD大鼠EGFR基因与GenBank数据库中发布的EGFR基因的cDNA序列,本试验发现了10个SNP位点,其中5个没有改变氨基酸残基的性质,这一研究结果为EGFR基因的SNPs数据库提供了新的信息。 相似文献
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试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子α1(tumor necrosis factor alpha 1,TNFα1) EST序列为基础,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.9×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得3个阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含128 bp的5''非编码区(5''-UTR),423 bp的3''非编码区(3''-UTR),开放阅读框ORF长768 bp,共编码255个氨基酸,在其3''非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。预测蛋白等电点为8.20,分子质量大小为28.1 ku。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼TNFα基因的同源性达94%。蛋白质的序列和结构分析结果发现,其具有TNF家族的典型序列特征、1个跨膜区结构和1个假定的产生成熟肽的裂解位点。 相似文献
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根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种Ets-1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Ets-1基因的cDNA序列。该序列全长2 263 bp(GenBank登录号HQ589338),包括5’UTR 331 bp,CDS 1 326bp和3’UTR 606 bp,编码441个氨基酸组成的蛋白质。核苷酸序列分析发现,山羊编码序列与牛、猪、人、小鼠等的相应序列同源性分别为98%、94%、92%和90%,3’UTR相应序列为96%、83%、81%和77%,5’UTR相应序列为98%、85%、82%和71%。氨基酸序列分析发现,山羊与牛、猪、人和小鼠的Ets-1的相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析发现,其蛋白质分子量为50 340.8 D,等电点为5.08,具有典型的螺旋-转角-螺旋结构域,不存在跨膜结构,并且整个序列不含信号肽。 相似文献