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口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：10，自引：3，他引：7
根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段，经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后，与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHT连接，得到了重组质粒pFB-P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后，将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac，经抗性及蓝白斑筛选，得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体，将其命名为Bacmid-P12X3C3D；提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞，最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。 相似文献
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将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清 相似文献
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口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建 总被引：4，自引：2，他引：2
采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1—2A、3C蛋白酶基因和3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入pGEM-T载体。然后，将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle—CMV。构建成功的2个重组穿梭质粒经测序鉴定，含有完整的目的基因表达盒。穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组，以产生重组腺病毒载体。 相似文献
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为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。 相似文献
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为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测 总被引：7，自引：0，他引：7
利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达. 相似文献
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为获得纯化的禽流感病毒(AIV)的NS1蛋白,将A/chicken/Guangxi/10/99(H9N2)(CK/GX/10/99)NS1全长核苷酸克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建了重组转移载体pFastBacHTA-NS1,然后转化入DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得表达NS1基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒转染昆虫细胞sf9进行NS1蛋白的表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot、间接免疫荧光(IFA)对表达的目标蛋白进行分析。结果表明,构建了含NS1基因的重组杆状病毒,分子质量约30ku的重组蛋白得到了表达,为NS1的相关功能研究奠定了基础。 相似文献
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PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿 相似文献
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羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：6，自引：0，他引：6
应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因,将其克隆至pMD18-T载体,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac-to-BacR杆状病毒表达系统中转移载体pFastBacl和pFastBacHTa,进而转化人含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得两种携带P32基因的重组转染质粒:Bacmid-Bacl-P32,Bacmid-BacHT-P32,经PCR试验鉴定,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体,可分别用于转染Sf-9昆虫细胞以获得单一重组P32蛋白和六聚组氨酸融合体重组P32蛋白. 相似文献
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为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。 相似文献
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为探讨口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素（IFN-α）基因共表达真核质粒进入临床试验的可行性,本试验用PCR方法扩增了口蹄疫病毒P12A3C及部分2B基因（P12X3C）和猪IFN-α基因,克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,经双酶切鉴定后,将重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α转染BHK-21细胞中,观察目的基因的表达,并将重组质粒免疫豚鼠,检测豚鼠的血清抗体水平、中和抗体滴度及T淋巴细胞增殖情况。结果显示,经酶切鉴定及DNA序列分析成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,转染BHK-21细胞后,通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定证实重组质粒能有效表达。ELISA结果显示,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α比重组质粒pBudCE4.1-P12X3C能诱导机体产生更高水平的抗口蹄疫病毒的血清抗体,且中和抗体滴度也高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组。MTT法检测结果表明,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组淋巴细胞增殖可达15%,而重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组则为11%。攻毒后重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组和灭活疫苗组保护率达100%,高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组的80%。本试验成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,猪IFN-α作为佐剂可有效辅助口蹄疫DNA疫苗提高动物体内的免疫反应。 相似文献
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O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 相似文献
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表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。 相似文献
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研究口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP) 2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面的意义.本研究将FMDV NSP 2C基因,克隆到穿梭载体pFast-bac- HT-B,将其转入含骨架载体Bacmid的DH10Bac,经蓝白斑筛选得到重组骨架质粒Bacmid-2C.将Bacmid-2C转染昆虫细胞Sf9,鉴定正确后,经3次增殖获得高滴度的P-3代病毒后,在High Five细胞中进行目的蛋白的表达.SDS-PAGE结果显示在High Five细胞中得到了相对分子质量约为38.93 ku的目的蛋白2C,Western blotting及Dot-ELISA结果显示,该表达产物对FMDV感染动物阳性血清有良好的反应性.以电泳纯化的2C蛋白为抗原建立间接ELISA,检测健康非免疫动物、免疫动物及FM-DV试验感染动物血清,结果表明2C-ELISA不但能区分免疫动物和感染动物的血清,而且还能检测FMDV感染早期动物血清中的2C抗体.说明昆虫细胞表达的2C蛋白可作为FMDV疫苗免疫动物与自然感染动物鉴别诊断的良好抗原.2C基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为建立通过检测几种NSP抗体,筛查感染及隐性带毒动物,净化畜群的方法奠定了基础. 相似文献
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设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBacTM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。 相似文献
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为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因 3D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180 bp的基因片段.将回收的目的片段与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为FMDV的阳性重组质粒.将验证正确的重组质粒10倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量PCR试验,建立FMDV 3D基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度.试验结果显示标准曲线的回归方程为Y=-3.727X+32.04,回归系数R2=0.980,熔解曲线为单一峰.建立的荧光定量PCR方法的灵敏度为1.2×101 拷贝/μL,只与FMDV反应.结果表明,建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测FMDV在动物组织细胞中的含量提供了技术方法. 相似文献
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为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础 相似文献