共查询到20条相似文献，搜索用时 23 毫秒
1.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
2.
猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达 总被引：2，自引：1，他引：1
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。 相似文献
4.
《黑龙江畜牧兽医》2010,(13)
为获得MarR多克隆抗体,试验以大肠杆菌ATCC25922基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的marR基因序列设计引物,PCR扩增出长约435bp的marR基因片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列的测序结果与GenBank中报道一致,从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ酶切回收435bp的目的片段,定向克隆到pET-28a(+)表达载体中,提取阳性质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中获得阳性克隆。结果表明:经IPTG诱导阳性菌收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marR基因得到表达;经Western-blot检测该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
5.
用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1／apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA／apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1．2％;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15．4％。利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1／apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA／apxⅠA分别进行表达。结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32％;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白。证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。 相似文献
6.
从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。 相似文献
7.
猪Ghrelin基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达． 相似文献
8.
9.
大肠杆菌多重耐药调控基因soxS的克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank中大肠杆菌的soxS基因序列设计引物,以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,PCR扩增出约324 bp的soxS基因片段,将所得片段与pMD18-Tsi mple vector连接,转化至J M109大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒序列测序结果与GenBank中报道一致。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ酶解,回收324 bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,再次转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,获得表达产物,通过SDS-PAGE检测出soxS基因的表达。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2016,(7):1178-1182
用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。 相似文献
11.
牛分枝杆菌Ag85A基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：1
以牛分枝杆菌Valleelll染色体DNA为模板，以Ag85A成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增，获得了900bp的DNA片段。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定，成功地构建出了克隆载体pGEM-T-85A。 相似文献
12.
根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。 相似文献
13.
提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA，用特异性引物通过RT—PCR反应获得了约750bp的核酸片段，将其与pGEM—T Easy载体连接，并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序，证明所克隆的片段含有完整的VP1基因；将重组质粒与表达载体pcDNA3．1( )分别用Barn HⅠ和Eco RⅠ双酶切后连接，构建成重组表达质粒，转化宿主菌DH5α，筛选阳性克隆。测序结果证明，目的基因正确插入到表达载体中，命名为pcDNAV；用同样方法将IL-18基因插入pcDNAV中，命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠，2周后加强免疫1次，每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明，pcDNA VI可引发机体产生体液免疫。 相似文献
14.
提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段，将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中，并转化至大肠埃希氏菌JM109中；经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern-blotting检测，表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆。 相似文献
15.
分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。 相似文献
16.
《贵州畜牧兽医》2015,(6)
利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
17.
对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。 相似文献
18.
犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
19.
利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础. 相似文献
20.
以牛乳腺组织总RAN为模板,经RT-PCR得到牛乳铁蛋白基因的N-lobe片段并将其克隆到pGM-T克隆载体上,最后将其连入表达载体pPICZαA中,构建牛乳铁蛋白基因N-lobe的酵母表达载体。结果表明：克隆片段大小为1028bp,与Gen Bank中登录的序列的相应部位相比,所获牛乳铁蛋白N-lobe cDNA序列的同源性为99.7%;重组表达质粒经酶切和PCR鉴定构建正确,为酵母表达乳铁蛋白基因N-lobe奠定了基础。 相似文献