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《中国预防兽医学报》2020,(5)
正猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属的一员,是一类非常小的无囊膜的单股环状DNA病毒。PCV2病毒直径约为17 nm,基因组含有1 766 nt～1 768 nt核苷酸,主要包含4个开放阅读框架(Open reading frame, ORF), ORF1～ORF4,其中ORF2编码病毒的唯一结构蛋白,即衣壳蛋白(Capsid protein,Cap蛋白),与病毒感染和免疫息息相关。PCV2是一种 相似文献
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河北省猪Ⅱ型圆环病毒的血清学调查 总被引：2，自引：0，他引：2
猪圆环病毒(Porcine circovirus，pcv)首先由Tischer于1974年从PK—15猪肾传代细胞系中分离获得。猪圆环病毒为无囊膜单股环状DNA病毒，属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，该科还包括人TT病毒(TTV)，鸡贫血病毒(CAV)，鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)等。病毒粒子直径17～20nm，为已知最小的动物病毒之一。PCV根据其抗原性及基 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(4)
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)基因有两个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF)。其中,ORF2编码病毒的主要结构蛋白核衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞中表达Cap蛋白,本研究将重组穿梭质粒Bacmid-iel-ORF2经脂质体转染至昆虫细胞中,获得重组杆状病毒。经过噬斑克隆实验,获得稳定、高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,病毒滴度可达到1×109 pfu/m L。免疫印迹实验表明重组Cap蛋白可与PCV2阳性血清发生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为提高PCV2灭活疫苗病毒滴度及免疫原性奠定了基础。 相似文献
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2008年7月末,我国青岛即墨地区患病的虎皮鹦鹉幼雏出现体重下降、脱羽和羽毛变形萎缩、鸟喙变形及胸腺结构变异等症状,怀疑为鹦鹉喙羽病(PBFD)。利用PCR对濒死鹦鹉进行鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)的检测,并对扩增的C1基因进行了测序与分析。结果表明,有两只检测为PBFDV阳性,B last分析发现,QD-CN08株与GenBank中已发表的PBFDV分离株C1基因同源性为82%~93%,进化树分析表明与日本的毒株有比较近的亲缘关系。结合临床症状、流行病学特征和实验室诊断,确诊为鹦鹉喙羽病,此病为中国大陆首次报道。 相似文献
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鹦鹉喙羽病(PBFD)是鹦鹉目前最常见的疾病,对鹦鹉养殖业危害极其严重。根据鹦鹉喙羽病毒(PBFDV)基因片段的克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以CP基因为模板,经PCR扩增获得830 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记DNA,制备用于检测PBFDV的特异性核酸探针。用该核酸探针对疑似感染PBFDV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的PBFDV进行全基因组扩增和测序分析。结果显示,利用PCR结合斑点杂交技术检测PBFDV,特异性强、敏感度高,具有可重复性。鉴定为阳性的2株PBFDV全基因组序列之间同源性为100%,与已报道序列的同源性为81.5%～98.9%。本研究为我国开展PBFDV感染的分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感、特异的检测方法。 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达 总被引：2，自引：1，他引：1
猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap.本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定.将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白.根据文献报道,致病性的PCV-2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX-6p-1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段.通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE结果,重组质粒pPRO-Cap和pPRO-Rep以及pGEX-△Cap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%.将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV-2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX-△Cap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV-2感染用候选抗原. 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORFl和ORF2基因的克隆与表达 总被引：5，自引：4，他引：5
猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。 相似文献
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为了解2017—2018年鹦鹉喙羽病在福建省某些地区鹦鹉中的流行情况,收集了福建省部分地区298份鹦鹉粪便样品,采用PCR方法进行粪便样品检测,对其中鹦鹉喙羽病病毒检测呈阳性的5个地区的样品进行衣壳蛋白(Cap)基因测序后比较其同源性,绘制系统进化树,分析氨基酸序列,并通过生物信息学及序列分析软件预测Cap蛋白二级结构及B细胞抗原表位。结果显示:鹦鹉喙羽病病毒的平均阳性率为41.28%,福州市某动物救助站和福州动物园的阳性率较高,分别为65.17%和64.29%,其次为三明动物园、福州市花鸟市场和福州市某鹦鹉繁殖基地,南平动物园的阳性率最低;所测5个毒株Cap基因与GenBank中新西兰株(AY518913)亲缘关系较近;Cap蛋白有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区域,具有潜在的B细胞抗原表位,位于5~27、110~127和141~153位氨基酸残基或其附近。研究结果对防控鹦鹉喙羽病,保障鹦鹉健康养殖有重要参考意义。 相似文献
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为了获得具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白,笔者通过PCR方法获得鸭圆环病毒I型完整Cap基因片段,将其克隆到昆虫杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒qBac-P-Cap,其病毒效价TCID_(50)可以达到9.25。重组杆状病毒可在悬浮Sf9细胞中表达具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白。研究表明蛋白表达最佳收获时间为120 h,纯化后蛋白表达量可以达到200μg/mL。这为进一步研究Cap蛋白功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
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2018年山东省某养殖场发生大量幼龄鹦鹉死亡事件,疑似为病毒感染。为探寻病因,开展了该场及省内另外两个鹦鹉养殖场的流行病学调查。利用PCR技术对临床样品中提取的DNA或RNA进行检测,结果发现新城疫与禽流感病毒均呈阴性,而禽多瘤病毒(APV1)与鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)呈现为强阳性,由此推断此3个鹦鹉养殖场存在APV1和PBFDV感染,平均病毒检出率分别为67.9%与71.4%,共感染检出率率为58.0%。对阳性样品进化全基因分析发现:区域内的PBFDV流行毒株同源性高,与该地区早期报道的毒株亲缘关系较为接近;APV1的VP1基因同源性较高,与欧洲分离毒株亲缘关系较为接近,说明我国流行的APV1或来源于进口鹦鹉。本研究警示,需要加强鹦鹉疾病防控,严格鹦鹉进出口检疫,并制定和健全标准的鹦鹉病检疫程序。 相似文献
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猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。 相似文献
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以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。 相似文献
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为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。 相似文献