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1.
应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ融合蛋白能促使人乳腺癌细胞MDA231细胞增殖,表明具有生物活性。 相似文献
2.
Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku.利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体.Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并且该抗体仅在精巢中检测到EsDMRT-like蛋白的表达,分子量约为52 ku,为预期单体分子量的二倍.Western-blotting检测变性后精巢总蛋白,该抗体能识别52和34 ku两条条带,证明了二聚体的存在.这一结果暗示EsDMRT-like可能通过形成二聚体形式调控中华绒螯蟹精巢发育. 相似文献
3.
本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式.结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高.对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59.该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好.Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达.对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功.选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白pET-32a-CD59的抑菌活性.研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性.本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础. 相似文献
4.
实验进行了青鱼( Mylopharyngodon piceus ) Dazl 基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼 Dazl 基因的编码区利用重组表达引物从pCS2- MpDazl 质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a- MpDazl 重组表达载体。然后将pET-28a- MpDazl 重组质粒转化至大肠杆菌( Escherichia coli )BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和 Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a- MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。 相似文献
5.
为了对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株毒力相关转录调控因子rovS进行克隆及表达研究,实验根据GenBank上登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的rovS基因,然后将该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果显示,该基因有849个碱基,编码282个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603 V与ATCC13813的rovS基因的同源性最高;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为34 ku;用亲和层析后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测效价达到1∶512000.研究结果表明,实验成功克隆与表达了rovS基因,为深入探讨RovS调节因子在调节细菌的代谢、生长和毒力等多种生命活动中的作用提供了理论依据. 相似文献
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鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。 相似文献
7.
LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用protein A纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600。紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础。 相似文献
8.
从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB.通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.重组蛋白主要以包涵体形式存在.亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克隆抗体.ELISA检测抗体效价均高达1:80 000,Western blot鉴定该抗体能特异性识别重组蛋白,而且均能够从卵巢总蛋白中检测到cyclin B蛋白.在中华绒螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白出现2种亚型,在罗氏沼虾未成熟卵巢中只有1种亚型,推测虾和蟹cyclin B蛋白调控卵母细胞成熟的分子机制不同.本研究制备了cyclin B抗体,旨为在蛋白水平研究cyclin B在卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础条件. 相似文献
9.
为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。 相似文献
10.
将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30 ℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强的生物活性,其与丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌等均有结合能力。 相似文献
11.
Nesfatin-1蛋白可以通过调节基因表达及信号通路途径影响鱼类的脂肪生成和代谢。为探究大口黑鲈(Micropterus salmoides) Nesfatin-1蛋白的生理功能,构建其原核表达质粒并进行蛋白表达纯化,制备了该蛋白的鼠源多克隆抗体。通过扩增Nesfatin-1蛋白的基因序列,构建原核表达载体获得pET32a-Nesfatin-1重组质粒。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,镍离子亲和层析法纯化融合蛋白,并免疫Balb/c小鼠,获得针对Nesfatin-1的多克隆抗体。结果显示：大口黑鲈Nesfatin-1蛋白的基因序列为246 bp;Nesfatin-1融合蛋白在菌液上清液中的质量浓度为1.05 mg·mL-1,相对分子质量约为30 kD;Western blot结果显示多克隆抗体能与重组蛋白特异性结合;间接ELISA检测该抗体效价达到1∶204 800以上;免疫组织荧光结果显示该抗体能特异性识别大口黑鲈肝胰腺中的蛋白,弥散性分布于肝胰腺中且血管周围呈强阳性反应。研究成功表达纯化出大口黑鲈Nesfatin-1融合蛋白,并制备了... 相似文献
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为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/pET28a质粒,导入到E. coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 kDa的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IGF-Ⅱ重组蛋白具有体外细胞水平的生物活性。本研究结果可为认识鱼类IGF-Ⅱ生理功能及半滑舌鳎生长调控机制提供理论支撑。 相似文献
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以盐藻总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了盐藻DsCDPK基因的cDNA序列,将其克隆到pMDTM19-T simple载体上,经测序获得的克隆片段全长1650 bp,与已发表的盐藻DsCDPK(GenBank:JQ964113)的编码区序列同源性达100%。将DsCDPK基因的开放阅读框与质粒pET-32a(+)连接,构建原核表达载体pET-32a-DsCDPK。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导融合,蛋白在大肠杆菌BL21中得到成功表达。通过SDS-PAGE检测发现,融合蛋白为部分可溶性表达,将上清蛋白经过His柱纯化后获得了纯度较高的可溶性融合蛋白,Western杂交检测显示,融合蛋白能被抗His单克隆抗体特异性识别,初步证明该融合蛋白就是带有His标签的DsCDPK蛋白。采用实时荧光定量PCR方法分析了高盐胁迫下DsCDPK基因的表达模式。试验结果表明,盐藻DsCDPK基因为盐胁迫上调基因,在高盐(3.0 mol/L NaCl)胁迫下,DsCDPK基因表达量显著增加,盐胁迫1 h时表达量达到最高,为正常生长状况(1.0 mol/L NaCl)下的3倍,差异达到极显著水平(P<0.01)。该研究成果为进一步阐明盐藻钙依赖蛋白激酶基因的功能及作用机制奠定了基础。 相似文献
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淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。 相似文献
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LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL。鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28%,且免疫后4周的血清抗体滴度为1∶800。该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础。 相似文献
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《渔业科学进展》2017,(3)
本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式。结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高。对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59。该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好。Western blotting分析结果显示,重组蛋白p ET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达。对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功。选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白p ET-32a-CD59的抑菌活性。研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础。 相似文献
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日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。 相似文献
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根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1 588 bp,分析表明该基因的开放阅读框为1 569 bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02 ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1 569 bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度1 mmol/L的IPTG对其进行诱导表达4 h,SDS-PAGE电泳分析表明,pET-28a-PPARγ1569菌株在66 ku 处有1条特异的蛋白带,Western-blotting 检测表明该蛋白为鲈PPARγ融合蛋白。用镍离子亲和柱纯化的鲈PPARγ融合蛋白免疫小鼠得到其多克隆抗体。用间接ELISA法检测鲈PPARγ抗体的抗体效价约为1∶16 000。实验结果为进一步研究鲈PPARγ蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。 相似文献
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为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体,笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列,将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白,通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性,用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/Eakr原核表达载体,并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。 相似文献