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1.
犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。 相似文献
2.
为制备携带猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169～aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829～aa837)的融合基因(PCV2-Cap169～180-E2829～837)经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化... 相似文献
3.
为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(4)
为制备猪星状病毒1型(PAstV1)Cap蛋白高变区特异性多克隆抗体,本研究根据PAstV-GX1株Cap蛋白Cs(aa420～aa669)基因序列设计引物,PCR扩增该片段(Cs)后克隆于pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-Cs,将其转化E. coli BL21感受态细胞,经终浓度1 mmol/L的IPTG在37℃诱导6 h后经SDS-PAGE检测表达产物,结果显示在大约47 ku处出现目的蛋白,且该蛋白以可溶性形式表达。将重组Cs蛋白经Ni柱纯化后乳化,按100μg/只免疫6周龄BALB/c小鼠,三免后5 d采血分离血清,经western blot和间接免疫荧光检测结果显示,获得的Cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别PAstV-GX1感染的PK15细胞表达的病毒蛋白。本研究首次制备的PAstV Cap蛋白高变区纯化蛋白及其多克隆抗体为后续PAstV病原学研究奠定了基础。 相似文献
5.
《中国兽医杂志》2018,(10)
为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
6.
《动物医学进展》2021,42(1)
克隆并原核表达新疆株猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)基因,为PCV3检测试剂的研发奠定基础。采用PCR扩增PCV3新疆分离株的Cap基因,采用Chou-Fasman法、Karplus-Schulz法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测蛋白的二级结构、蛋白质骨架区的柔韧性、亲水区/疏水区、可及性和抗原指数,将PCV3 Cap基因克隆到pEASY-Blunt Simple载体,经HindⅢ、NdeⅠ双酶切,亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap,测序验证后转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行分析鉴定。结果显示,成功扩增并克隆到新疆株PCV3 Cap基因,通过序列分析发现所获PCV3 Cap基因与参考毒株的同源性为98.0%～98.6%之间,推导氨基酸有6个点突变,分别位于24、27、29、56、75、77和150aa位置;在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181和192-202aa含有潜在B细胞抗原表位。构建了重组原核表达质粒pET30a-PCV3-Cap,并在大肠埃希氏菌中表达了重组PCV3 Cap蛋白,分子质量约为32 ku,该重组蛋白以包涵体的形式存在,Western blot鉴定表明,带His标签的重组蛋白能被His单克隆抗体识别。成功克隆并原核表达了新疆株PCV3衣壳蛋白,为PCV3诊断试剂的研发奠定了基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(8)
本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
8.
为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号：MH922991.1)的ORF2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示：重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显... 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2019,(24)
为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。 相似文献
10.
为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber... 相似文献
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研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。 相似文献
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本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。 相似文献
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A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献
14.
作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础. 相似文献
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为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD18-T载体,进行测序;将△Cap基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,△Cap融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的22.1%。 相似文献
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为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
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应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础． 相似文献