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1.
为探讨经黏膜途径免疫接种猪流感病毒(SIV)多肽疫苗的可行性,选择STV主要结构蛋白血凝素(HA)的T、B抗原表位,将多个表位片段串联,定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,对串联表达的重组猪流感病毒蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2进行了小鼠免疫试验。重组蛋白以包涵体形式表达,经洗涤定量后,采用灌胃途径免疫6周龄KM小鼠,检测免疫小鼠抗体及细胞免疫水平。结果发现三免后各免疫组血清IgG抗体与PBS对照组差异极显著(P<0.01);黏膜分泌型IgA抗体,所有免疫蛋白组与PBS组差异均极显著(P<0.01);细胞免疫检测,所有免疫组小鼠外周血T淋巴细胞增殖明显;猪流感病毒血凝抗体检测,SIV-ep1免疫组、SIV-ep2免疫组、SIV-ep1与LT蛋白免疫组抗SIVH1N1亚型HI效价达1:1024,SIV-el2蛋白免疫组HI效价达1:512。结果表明,猪流感病毒重组多表位抗原灌胃免疫小鼠,能产生理想的黏膜免疫抗体和血清抗体。 相似文献
2.
根据H9N2亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,从本室分离保存的H9N2亚型猪流感病毒中扩增出血凝素基因,并将其克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定后,进一步将其信号肽缺失并亚克隆到pGEX-KG中,使其在E.coli BL21（DE3）中与GST融合表达。SDS-PAGE显示表达的融合蛋白的相对分子质量约为90 000。Western印迹表明表达的蛋白质具有免疫学活性。表达产物位于包涵体中,包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原,经碳二亚胺（EDAC）将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,建立了H9亚型猪流感病毒抗体的乳胶凝集试验的检测方法,结果表明,应用HA重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型猪流感抗体水平监测、流行病学调查和现地疫病普查。 相似文献
3.
袁芳艳;刘泽文;周丹娜;杨克礼;段正赢;郭锐;田永祥 《湖北畜牧兽医》2013,(9):5-8
利用RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因,亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子,经SDS-PAGE和Western-blot检测,H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达,产物约60.4KD,并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。 相似文献
4.
从H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR克隆全长血凝素(Hemagglutinin,HA)基因,并进一步克隆HA的主要抗原区HA1基因.将HA1克隆到原核表达载体pGEXKG,与谷胱苷肽(GST)融合表达,表达的融合蛋白GST-HA1以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性处理,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的免疫学活性.ELISA检测发现,GST-HA1只能与H9亚型禽流感病毒抗体发生反应,而与H5和H7亚型禽流感病毒抗体无交叉反应.进一步将纯化的融合蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠,免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体.制备的HA1蛋白特异性强,具有良好的免疫原性,为禽流感病毒的鉴别诊断和禽流感疫苗开发奠定了基础. 相似文献
5.
血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010（H3N2）的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a（+）原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21（DE3）pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2 ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。 相似文献
6.
研究以新城疫病毒(NDV)弱毒株LX为载体,构建了一株表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)血凝素(HA)胞外区的重组病毒(LXs HA),并与一株前期构建的表达膜结合型HA的重组病毒(LXHAF)进行比较。生物学特性评价显示,两株病毒均为弱毒且在鸡胚中的繁殖性能较强。此外,LXs HA主要以分泌形式表达HA蛋白,而LXHAF则以膜结合形式表达HA。鸡的免疫试验显示,两株重组病毒在一次免疫后均能诱导针对NDV载体的血凝抑制抗体,但LXHAF能够诱导较高水平的H7N9 AIV特异性Ig Y抗体,而LXs HA不能诱导H7N9 AIV抗体应答。结果表明,表达膜结合型HA的重组病毒具有针对H7N9 AIV较好的免疫原性,而表达分泌型HA的重组病毒免疫原性较差。这为研发H7N9亚型禽流感载体疫苗提供新的信息与参考。 相似文献
7.
本试验利用生物软件对H5亚型禽流感病毒A/CK/GD/178/04的血凝素进行抗原特性分析,结合关于禽流感病毒血凝素抗原位点的文献报道,选定97～212位氨基酸和369～529位氨基酸两个区域作为多肽表位候选区域.利用本实验室自主研发的原核表达载体pBT载体,串联表达HA的两个区域,经SDS-PAGE和Western Blotting分析,证明重组产物得到表达,Ni2+柱纯化重组蛋白后,对2周龄SPF鸡进行免疫,经HI试验检测该重组蛋白可以刺激机体产生HI抗体.本研究为H5亚型AIV多肽疫苗的进一步研制奠定了基础. 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。 相似文献
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H5N1和H9N2禽流感病毒HA抗原性对比分析和基因免疫研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据H9N2和H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因序列，设计合成全基因扩增引物．将RT—PCR扩增2个毒株的HA基因进行序列测定．对推导的氨基酸序列通过MIF Bioinformatics软件进行抗原表位分析和糖基化位点进行分析。构建2个基因的真核表达质粒．检测2个毒株的HA基因疫苗免疫后外周血中HA特异性抗体的效价．并比较HA2个亚型免疫应答特异性的差异。结果表明，2株毒株禽流感病毒血凝素抗原表位和糖基化位点存在较大差异，重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应。两种亚型禽流感的HA基因免疫诱导的对本亚型病毒的抗体应答水平明显高于另一亚型． 相似文献
10.
猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物,从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌中诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot的结果表明,HA基因在大肠埃希菌中获得表达,产物具有免疫学活性,表达蛋白分子质量约为55 ku.表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法.该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好.应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测,结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性,平均为20.5%.在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰,分别高达25.4%、25.0%和35.5%. 相似文献
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为了克隆和表达编码扩展莫尼茨绦虫无精症缺失(DAZ)基因,试验根据GenBank中扩展莫尼茨绦虫DAZ基因cDNA序列(登录号为GH291478)设计1对特异性引物,以扩展莫尼茨绦虫组织总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZ基因,并克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,构建重组质粒pET28a-DAZ,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析表达产物,通过螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明:重组DAZ基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白分子量约为14 ku。 相似文献
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新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力相关基因E9的序列,设计并合成了1对特异性引物,以IMT5155菌株的基因组DNA为模板扩增了E9基因所在ORF的部分序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)载体中,构建了原核表达质粒pET-28a-E9,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(32.2 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有免疫反应性。对重组蛋白进行纯化后免疫动物进行抗体效价测定,进一步分析重组蛋白的相关生物学功能,分别进行了细胞毒性试验、动物试验、细胞黏附与黏附影响试验。结果表明,该蛋白没有细胞毒性,对小鼠亦无毒性,有一定的黏附作用。 相似文献
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SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础. 相似文献
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参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的基因组序列，设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1—6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX—KG中，经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃，1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子量约为40ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western—blotting检测表明，表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。 相似文献
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Zhang XH He KW Zhao PD Ye Q Luan XT Yu ZY Wen LB Ni YX Li B Wang XM Guo RL Zhou JM Mao AH 《The Veterinary record》2012,170(7):178
Ruminants are an important reservoir of Escherichia coli O157:H7. To reduce E coli O157:H7 excretion by these animals could play a key role in prevention and control of human infections. In the present study, the authors used 12 three-month-old goats to evaluate the efficacy of intranasal administration of the Stx2B-Tir-Stx1B-Zot protein. These goats were inoculated on days 0 and 21 and infected with 10(10) colony-forming units (cfu) of E coli O157:H7 by oral inoculation on day 36. Faecal shedding was monitored daily for two weeks. All of six goats immunised with recombinant protein elicited significant Stx2b-Tir-Stx1b-Zot-specific serum IgG antibodies, and three of them also showed production of antigen-specific IgA in faeces. The immunised goats showed much less shedding of E coli O157:H7 after challenge. These results demonstrate the potential for the use of Stx2B-Tir-Stx1B-Zot protein in mucosal vaccine formulations to prevent colonisation and shedding of E coli O157:H7 in goats. 相似文献
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根据克隆的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株微线蛋白-2基因(EnMIC-2(Gd))的cDNA序列设计特异性引物，用PCR方法扩增其阅读框架(ORF)后，克隆至质粒表达载体pET-32a( )，成功构建了重组表达质粒pET-32a( )-EnMIC-2。用CaCl2法将其转化至宿主细菌E.cliBL21(DE3)，并用IPTG成功诱导了EnMIC-2重组抗原在大肠杆菌表达。表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的10．8％，其相对分子质量约为55000。重组蛋白经SDS-AGE分析后，用E．necatrix(广东株)感染鸡的高免血清进行Western Blotting分析，结果为阳性。 相似文献
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本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
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为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献