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旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制备的多抗进行激光共聚焦免疫荧光定位。结果显示,获得的EnOXIO1基因全长为2 535 bp,体外重组表达的蛋白大小约100 ku,主要以包涵体的形式存在,表达量约为0.5 mg·mL-1。Western blot分析结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体识别,同时能被制备的鼠多抗以及毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明该重组蛋白具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果显示,EnOXIO1基因表达产物主要存在于配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。本研究成功克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白,并将其定位于配子体和卵囊壁上,为进一步解析EnOXIO1蛋白参与卵囊壁形成的分子机制奠定基础,为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。 相似文献
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鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。 相似文献
4.
为进一步研究柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白,应用RT-PCR从柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子总RNA扩增表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233),与pGEM-T easy载体连接,扩增目的片段后分别双酶切扩增产物与pET-28a(+),连接转化至BL21后,诱导表达,分别获得两种重组蛋白。SDSPAGE结果表明,两种重组蛋白的分子质量均为32ku,为包涵体蛋白形式。分别以感染柔嫩艾美耳球虫的鸡血清和重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体作为一抗,经Western blot分析,结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。通过对这两种表面抗原基因的研究,为基因工程疫苗的研究提供一定的理论依据。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(2)
为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(5)
本文采用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,用oliogo(d T)磁珠法纯化m RNA后,采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,原始文库容量为2.14×106pfu/m L,扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/m L,扩增文库的重组率为90%。随机挑取100个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400~1000 bp为主。本研究结果为毒害艾美耳球虫新基因的筛选和功能研究奠定了基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(8):72-75
为了研究毒害艾美耳球虫蔗糖非酵解解旋酶2(SNF2)基因的功能,以提取的毒害艾美耳球虫子孢子总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增SNF2基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体,测序后构建pET30a-EnSNF2表达载体,转化大肠杆菌BL21,重组菌经测序鉴定后诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果显示:克隆的片段长822 bp,编码274个氨基酸;重组蛋白大小为36 ku左右,以包涵体形式为多,能被组氨酸(HIS)单抗特异性识别,表明该基因片段获得成功表达。研究结果为制备针对毒害艾美耳球虫SNF2的多抗和进一步研究该基因的功能奠定了基础。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。 相似文献
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为了研究外源基因表达对转基因柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)生物学特性的影响,对转基因球虫(TE1)和BJ株(野生强毒)的发育和致病性进行比较分析.结果显示,相对于BJ株,转基因球虫TE1株繁殖力下降约4倍,低剂量感染时致病性下降明显,但是高剂量感染时依然保持较强的致病性.另外,在荧光显微镜下发现,TE1有滋养体、第一代裂殖体/裂殖子、第二代裂殖体/裂殖子和大小配子体等内生发育虫体.孢子化卵囊内4个孢子囊并非全部表达黄色荧光蛋白.这些结果说明黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的表达在一定程度上降低了转基因柔嫩艾美耳球虫致病性和繁殖力.在柔嫩艾美耳球虫合子减数分裂过程中,存在同源或异源染色体重组现象. 相似文献
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This assay was aimed to express the PuAH gene of Edwardsiella tarda (E.tarda) EIB202 and analyze its partial characteristics.A pair of specific primers was designed based on the PuAH gene sequence of E.tarda published in GenBank(accession No.:CP001135,CDS No.:ETAE_0818).The gene was cloned and expressed by recombinant plasmid pET32a-PuAH in E.coli BL21(DE3).The recombinant protein was purified and used to immune New Zealand rabbits to prepare antisera.Then the characteristics of expression product and antisera were analyzed by ELISA,Western blotting,hemolysis test and bacterial agglutination test.In conclusion,the expression product was fusion protein with 42 ku molecular weight,and had immunogenicity and antigenicity,but no hemolytic to erythrocytes of eel.Yet the antisera could inhibited the hemolytic of outer membrane protein of E.tarda EIB202 to some extent,and could agglutinate E.tarda EIB202. 相似文献
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In this study,encephalomyocarditis virus 2A protein was prokaryotic expressed and purified.E.coli was used to express foreign proteins,the EMCV 2A gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-sumo to obtain the recombinant plasmid pET28a-EMCV-2A and confirmed by PCR and sequencing.The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).After ultrasound fragmentation,the expression of 2A protein was mainly in the form of inclusion bodies.By optimizing the protein expression conditions,the soluble expression of the target protein could be achieved.The recombinant protein was purified by beads and identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed.The molecular weight of the recombinant 2A protein was about 25 ku.The best condition was 16 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG,about 50% of the proteins were soluble.The purified recombinant protein was double-stained by SDS-PAGE and Western blotting,and indicated that the purified protein was the recombinant protein.The study provided the basic theoretical basis for elucidating the molecular pathogenesis of EMCV and preparation of gene vaccines and antiviral drugs. 相似文献
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本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。 相似文献
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WU Hong-chao LIU Xiao-ying FENG Er-kai ZHU Yan-zhu WAN Hong-li FENG Zhuo YAN Xi-jun CHEN Li-zhi 《中国畜牧兽医》2015,42(11):2843-2849
In order to analyze the immunogenicity of 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum,specific primers were designed to amplify the 3 truncated overlapping gene fragments covering the whole open reading frame (ORF) based on the result of antigenic epitope analysis.The gene fragments were ligated into the prokaryotic expression vector to construct pET-28a-p1,pET-32a-p2 and pET-32a-p3,respectively.Then recombinant plasmid was induced expression in E.coli.The SDS-PAGE results showed that the expression of recombinant proteins P1,P2 and P3,molecular mass of the expressed proteins were about 48,59 and 62 ku,respectively.Western blotting indicated that the recombinant proteins could be recognized by antiserum against F.necrophorum from mouse.Humoral immunity response against recombinant proteins was detected in the immunized rabbits.Altogether,these findings suggested that 120 ku hemagglutinin-related outer membrane protein from F.necrophorum had good immunogenicity,and this study provided a reference for further research on genetic engineering subunit vaccine of F.necrophorum. 相似文献
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Interferon (IFN) had recieved much more attention because of its broad-spectrum antiviral, antitumor activity and immune regulation.One pair of primers were designed for amplifying pig IFN-δ gene with PCR method according to the relevant sequence from GenBank.The IFN-δ gene was cloned into prokaryotic expression vector, and the recombinant plasmid was obtained.We transformed the recombinant plasmid into E.coli Transetta BL21(DE3) strain and the protein expression was identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that pET-30a-DsbA-IFN-δ recombinant protein was 20 ku and expressed mainly in the form of inclusion body, these expressed protein could specific react with His-tag monoclonal antibody. 相似文献
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干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
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[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。 相似文献
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[目的] 获得抗原性好的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。[方法] 根据GenBank ASFV参考序列（登录号：NC_044959.2）合成360-12L基因,并插入pET-28a（+）载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。[结果] 成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37 ℃ 6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1：512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体具有良好的特异性,可特异性识别12L重组蛋白。[结论] 原核表达的12L重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究12L蛋白的生物学功能、ASFV血清学诊断技术和疫苗研究提供生物材料。 相似文献