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Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(6)
IKK复合体由IKKα、IKKβ和IKKγ3个亚基组成。早期研究结果表明催化亚基IKKα在调节β干扰素(IFNβ)产生方面发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染及其非结构蛋白4(NSP4)表达能够显著抑制宿主的天然免疫反应。本研究结果显示PRRSV NSP4可以与IKKα结合,并能够切割IKKα。而且,丝氨酸蛋白酶活性是PRRSV NSP4切割IKKα所必需的,其中NSP4中的3个蛋白酶活性位点(His~(39)、Asp~(64)和Ser~(118))中任何一个发生突变均无法切割IKKα。进一步研究证明,NSP4通过切割IKKα抑制了NF-κB和IFNβ启动子的活性。本研究结果表明,PRRSV NSP4除了通过切割NEMO和MAVS抑制NF-κB和IFNβ启动子活性以外,也可以通过切割IKKα抑制机体NF-κB的激活和IFNβ的表达。这些研究结果为阐明PRRSV逃逸宿主天然免疫提供了一个新的证据,为深入研究PRRSV的致病机理奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(7)
为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从p UCm-CJpoIFN-α2、p UCm-CJpoIFN-α2β、p UCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体p BI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用q PCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;q PCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经4~7、4~9、4~7稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID_(50)PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。 相似文献
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根据干扰素(Interferon,IFN)产生的来源,可将其分为2种类型。Ⅰ型IFN包括IFN-α家族和IFN-β,IFN-α主要是由病毒感染的淋巴细胞、单核巨噬细胞分泌;而大多数细胞都可以分泌IFN-β,但主要是由成纤维细胞分泌。Ⅱ型IFN是IFN-γ,由激活的T细胞和NK细胞在识别感染细胞的过程中产生。因此,在病毒感染早期,细胞对抗病毒的感染主要依赖于Ⅰ型IFN的分泌,其中干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)对Ⅰ型IFN的产生起关键性作用。1 IRF-3的结构IRF-3是由427个氨基酸残基组成的、分子质量为55 ku的蛋白质。IRF-3… 相似文献
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干扰素的新家族--IFN-λs研究现状 总被引：1，自引：0，他引：1
干扰素λ(IFN-λ)家族是干扰素的一个新家族,不同于Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN,包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3(又称IL-29、IL-28A和IL-28B)。IFN-λs的信号转导机制类似于IFN-α,两者都是通过诱导受体异二聚体化,活化Jak-STAT信号通路,进而发挥抗病毒、抗细胞增殖等生物学作用。所不同的是IFN-λs是通过诱导其独特的Ⅱ型细胞因子受体CRF2-12/IFNLR1/IL-28Rα和CRF2-4/IL-10Rβ异二聚体化。IFN是第一个应用于临床的基因工程产品,IFN-α/β在治疗肿瘤和病毒性疾病等方面都取得了显著的疗效。IFN-λs与Ⅰ型IFN有着几乎相同的功能,是否具有独特功能,正在进一步的研究之中。 相似文献
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通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。 相似文献
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干扰素诱导抗病毒因子表达从而抑制病毒感染的能力依赖于细胞的抑制作用。RAS／MEK途径是细胞抑制作用的途径之一,因为在干扰素存在的情况下,Ras／MEK的激活使得病毒复制。本研究的机理如下：通过激活的Ras／激酶抑制干扰素效应发现,在Ras转化成NIH3T3（RasV12）细胞时,能诱导抗病毒蛋白的反应导致干扰素受损。抑制的Ras／MEK途径恢复了干扰素介导的诱导抗病毒基因,表明激活的Ras中断干扰素的上游抗病毒基因的转录通径。事实上,与矢量控制细胞相比,干扰素诱导磷酸化的信号转导和转录激活因子1（sTAT1）和2（STAT2）可抑制RasV12细胞。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(9)
为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2017,(7)
利用蛋白质组学的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(pulmonary macrophage,PAM)后的蛋白质动态变化进行探讨,为阐明病毒感染后引起的复杂免疫学反应及为该病的防控提供理论依据。通过Label-free LC-MS/MS方法定量鉴定PRRSV感染PAMs后差异表达细胞蛋白质。结果显示,共鉴定出430个显著差异表达蛋白质,其中包括171个上调表达蛋白质和259个下调表达蛋白质,这些蛋白质与细胞抗病毒天然免疫及抗原递呈等相关。值得关注的是,许多上调表达蛋白质都富集在与天然免疫相关的NF-κB、MAPK及RIG-Ⅰ等信号通路上,包括STAT1/2、OAS1/2、Mx1/2、ISG15/20、IFIT1/2/3/5等;下调蛋白质主要富集在MHCⅠ和MHCⅡ分子相关信号通路上。荧光定量PCR和Western blot结果证实,PRRSV感染导致了STAT1/2、OAS1/2、Mx1、CD14、ISG和IFIT等的转录或表达,这为进一步阐述PRRSV的感染机制奠定基础。 相似文献
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旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基... 相似文献
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王晔 《畜牧兽医科技信息》2018,(7)
转移生长因子-β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染宿主细胞的过程中发挥重要作用。基于此本篇通过RNAi技术从体外沉默藏猪外周血单核细胞(Tp-PBMCs)中TGF-β1基因表达并随即感染PRRSV为出发点,探究TGF-β1表达受抑对PR R SV复制、细胞活性以及免疫应答的影响。研究表明,随着TGF-β1基因表达的抑制,Tp-PBMCs中PRRSV复制被明显抑制,抑制率高达99.0%;细胞活性升高约150%~160%;并成功激活多个抗病毒免疫相关基因转录,其中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α干扰素(interferon-alpha,IFN-α)、γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)、α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factoralpha,TNF-α)、Toll样受体-3(toll-like receptor 3,TLR-3)的转录水平明显升高;而白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的mRNA水平明显降低。由此可见,用RNAi技术沉默TGF-β1基因表达不仅能抑制PRRSV的复制,还能激活免疫应答进一步抑制病毒感染的发生,从而为控制藏猪感染PRRSV提供了一条新的途径。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(1)
旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素(IFN)表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2～4倍(P0.001),随后检测到6种ISGs(IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2)转录量上调2～16倍(P0.01或P0.001);反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调(P0.01或P0.05),同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调(P0.05或P0.01)。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)的3′-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。 相似文献
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本文探讨聚合体形式的猪干扰素α真核表达质粒(p VAX1-PIFNα)对猪PRRSV弱毒疫苗免疫作用的增强作用。在猪免疫PRRSV弱毒疫苗的同时,注射p VAX1-PIFNα重组表达质粒与多聚赖氨酸(PLL)的聚合体(PLL-p VAX1-PIFNα),以研究聚合体状态的干扰素对PRRSV免疫的增强作用。将分泌表达干扰素α的重组真核表达质粒p VAX1-PIFNα与PLL聚合,同时免疫PRRSV弱毒疫苗和PLL-p VAX1-PIFNα聚合体,使用ELISA试剂盒检测PRRSV中和抗体;另外,分离培养猪外周血白细胞(PBMC)进行体外试验,分析PLL-p VAX1-PIFNα聚合体刺激淋巴细胞后IFN-γ的分泌情况。中和抗体的结果表明,PLL-p VAX1-PIFNα的使用可明显提高PRRSV活疫苗诱导产生PRRSV中和抗体的能力;细胞试验的结果表明,经PLL-p VAX1-PIFNα刺激后,明显提高了淋巴细胞分泌表达IFN-γ的水平。在PRRSV疫苗免疫中,聚合体状态的猪IFNα重组表达质粒可有效提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,这一结果也为干扰素或其他重组蛋白在疫苗免疫中的应用提供了新的思路。 相似文献
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为了解干扰素（interferon，IFN）和干扰素刺激基因在禽呼肠孤病毒（ARV）感染DF1细胞后的表达情况，试验将ARV病毒感染DF1细胞，观察细胞病变，收集感染后0、6、12、24、36、48、72、96 h的细胞样品，抽提反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR技术检测干扰素IFN-α和IFN-β及9种禽源常见干扰素刺激基因在感染后不同时间点在转录水平表达量的动态变化规律。结果显示，在ARV感染DF1细胞后，DF1细胞出现典型的细胞病变，感染后12 h病毒开始快速增殖，在36~96 h维持在较高的水平；IFN-α和IFN-β在转录水平的表达量在感染后均表现为显著下调（P<0.05；P<0.01）；IFI6、OAS、IFIT5、ISG12在转录水平表达量变化规律相似，均呈现显著上调表达（P<0.05；P<0.01），在感染后96 h达到峰值；其中IFIT5的上调幅度最大，感染后96 h的表达量是0 h的19.62倍（P<0.01）；而Mx、IFITM3、PKR、Viperin、ZAP的表达量变化规律相似，均表现为显著下调表达（P<0.05；P<0.01），其中Mx、IFITM3、Viperin的下调幅度较大，PKR和ZAP下调幅度很小。说明在ARV感染DF1细胞后，干扰素及多种干扰素刺激基因在转录水平呈现规律性变化，与病毒在DF1细胞中复制存在一定的联系。结果表明，ARV感染后可以诱导多种干扰素刺激基因的表达，这些干扰素刺激基因在抵御ARV病毒的入侵，抑制ARV的复制、释放及病毒的清除中发挥着重要作用。本研究为今后深入研究ARV的致病机理和宿主的抗病毒免疫应答提供了参考。 相似文献
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本试验通过研究免疫复合物影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在巨噬细胞内增殖的因素,来进一步探讨免疫复合物经FcγR介导的PRRSV感染机制.本研究将含200 TCID50 PRRSV病毒液与等体积的终浓度为1.30 mg· mL-1的猪IgG-兔抗猪IgG复合物分别先后和同时接种于PAM细胞,分别于12、24、36、48 h收集细胞液,同时设PRRSV感染对照组、免疫复合物对照组和健康细胞对照组,利用建立的相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR方法分别检测巨噬细胞中IFN-α、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平及PRRSV的RNA水平,并进行定量分析,同时采用ELISA方法检测健康细胞中IFN-α的蛋白水平.结果显示,在感染后12～36 h期间,免疫复合物能够抑制PRRSV诱导的IFN-α的mRNA水平,TNF-α mRNA水平在感染后12 h被促进,而在24～36 h期间被抑制.在感染后48 h,免疫复合物能促进IFN-α和TNF-α的mRNA水平,而在12～48 h期间均能抑制IL-10的mRNA水平,此外,免疫复合物在感染12、24和36 h时间段内均能明显促进病毒的增殖,但在48 h后不显著.健康细胞中IFN-α的蛋白水平在培养12～48 h之内呈“降-升-降”的趋势.结果表明,IFN-α蛋白的表达与其mRNA的转录不同步.在PRRSV感染初期,免疫复合物能抑制PRRSV诱导的抗病毒因子的mRNA水平,病毒的复制被促进,而在感染后期,抗病毒因子达到一定的浓度后发挥抗病毒作用,在一定程度上抑制病毒的复制.而TNF-α的转录规律不明显,表明免疫复合物可能同时与激活型和抑制型FcγR结合来共同调节PRRSV诱导的细胞因子的转录. 相似文献
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本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。 相似文献