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罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为进一步了解无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息,通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA,利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明,该基因包括3 405 bp的ORF,可编码1 134个氨基酸,与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、Clustal X 2.0和MEGA 5.05及在线分析工具ExPASy ProtParam、NCBI Proten blast及Conserved Domain等对推导的氨基酸序列进行分析,结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的氨基酸序列含有3个催化三联体(catalytic triad)位点、7个假定活性位点(putative active site)、2个特异位点(specific hits),以及4个超家族结构（2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53 superfamily、1个类纤连蛋白超家族结构 DUF1034 superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lg superfamily）;并且该氨基酸序列有多个抗原表位,推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性,可作为候选的蛋白疫苗成分。将该片段插入原核表达载体pET32a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆,经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a(+)/scpB。 相似文献
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(h/b)的克隆、表达及溶血活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性.[方法]PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应.[结果]测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103Hu·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应.[结论]成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础.此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法. 相似文献
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《中国农业科学》2009,42(1):324-330
【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU?mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103 HU?mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。 相似文献
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目的重组表达无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic protein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白.方法用PCR的方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a( )-SIP.用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-SIP融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中无乳链球菌(DQ650634)的SIP的基因序列同源性为98.62%.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a( )-SIP总蛋白中出现一条相对分子质量为71KDa的新蛋白带.West-ern blot分析显示,SIP蛋白可与无乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应.结论已成功表达SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础. 相似文献
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停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,根据GenBank中登陆的停乳链球菌表面蛋白MIG基因序列,设计一对引物,采用PCR的方法从临床分离的停乳链球菌内蒙分离株基因组DNA中扩增出MIG基因,得到1条1 900bp的片段.将其连入PMD - 19T载体中,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定.结果表明,MIG基因与GenBank中停乳链球菌MIG基因(AF354651)序列的同源性为95％.构建原核表达载体PET - 32a(+)- MIG,随后转化到大肠杆菌BL21( DH5a)中表达.表达产物进行SDS-PAGE分析后,表达的重组蛋白大小为89 ku.将纯化的MIG重组蛋白免疫兔,用ELISA检测其血清抗体.用制备出的抗血清与链球菌全菌进行玻片凝集试验,出现凝集颗粒.结果表明MIG重组蛋白具有较强的免疫原性,为停乳链球菌疫苗的研制奠定基础. 相似文献
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以本实验室由RT-PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白（bMT）cDNA的重组质粒pYJ101为模板，PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区，将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T-1，在E.coli中诱导表达bMTcin，经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明，所克隆的bMTcin序列全长为141bp，其DNA序列与原模板中的序列完全相同，与GenBank中另外5个bMTcinDNA相比，第31位和86位与Conneely的序列为A和G，导致第11位（Thr）第29位（Arg）的氨基酸不同于其他4个序列（11位为Ala，29位为Lys）。融合表达蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。 相似文献
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采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB. 相似文献
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为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAdN1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAdN1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR 方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋白做标记计算出20代次时重组病毒的滴度.结果显示:从各代重组病毒DNA 中均扩增出了约1 400 bp的目的条带,序列分析结果表明,第5、10、15代重组病毒中的NA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变(516位A→G,1 323位T→C),但其编码的氨基酸未发生变化,即蛋白抗原表位未发生变化;采用快速测定法计算出重组腺病毒的滴度为109.5 pfu/mL. 相似文献
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根据GeneBank上的猫IFN-β基因序列.设计了1对特异性引物,对猫肝组织中提取的DNA进行PCR扩增,然后将扩增产物插入pUCm-T克隆载体进行了克隆.测序分析表明,克隆的IFN-β基因序列与GeneBank中的基因(NM_001009297)存在一个碱基差异,第446位碱基由T变为C,二者同源性高达99.82%,同时这个碱基的差异没有引起氨基酸的改变.将其双酶切后插入原核表达载体pGEX-KG,构建成功重组表达载体pGEX-IFNB,将其转化BL21(DE3)后成功进行了诱导表达.SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,在35KDa处出现蛋白表达条带,表达量占菌体蛋白的12%.在Western-Blot中其能和GST抗体发生特异性反应,说明为GST-IFN-β融合蛋白. 相似文献
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链球菌通用PCR检测方法的建立及应用 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定. 相似文献
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为了解内蒙古地区隐性乳房炎无乳链球菌分离株耐药性及耐药基因,采集内蒙古不同地区的规模化养殖场隐性乳房炎乳样,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法测试分离株对16种抗菌药物的敏感性,PCR方法检测其耐药基因。结果显示:无乳链球菌对大部分抗生素较敏感。对其有较强抑菌作用的药物为:青霉素G、头孢噻肟、头孢唑啉、阿莫西林、红霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、林可霉素、呋喃妥因、万古霉素。其敏感性达到90%~100%。该菌株对四环素有较强的耐药性,耐药率达77.27%。PCR扩增四环素耐药基因tetM、tetO、tetK、tetL,结果显示22株无乳链球菌均含有tetM基因,其基因的检出率为100%。其中7株同时含有tetK基因,tetO、tetL基因未检出。 相似文献
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根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279 bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验... 相似文献
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猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用 总被引：10，自引：0，他引：10
根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子（extracellular protein factor，EPF）的基因序列，各设计合成一对引物，以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板，扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列，分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf，确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后，提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化，通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中，重组质粒转化入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白。用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位。用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物。证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原。 相似文献
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根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。 相似文献
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猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探 总被引：1，自引：1，他引：0
目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。 相似文献
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对猪链球菌ZKHY株的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)进行克隆和序列分析,以ZKHY株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出谷氨酸脱氢酶基因片段,克隆于pMD-18T载体,转化宿主菌JM109中进行序列测定。将测序结果与GenBank已登录序列进行核苷酸和氨基酸的同源性分析。序列分析显示,成功克隆了猪链球菌ZKHY株的gdh基因,ZKHY与已报道的猪链球菌gdh基因有密切的亲缘关系,核酸序列与血清2、7、9型的同源性为97.2%~98.4%,其中与2型菌株同源性为97.2%~97.3%;与7型菌株同源性为98.4%;与9型菌株同源性为97.6%。其编码的氨基酸序列同源性则更高,与GenBank中已收录的序列同源性在98.9%以上。ZKYH株可能是属于2、7、9型之外的其他血清型;所克隆的基因在猪链球菌之中非常保守,可以进行表达以用作免疫学方面的相关研究。 相似文献
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【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因（ifi44）在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸［Poly（I:C）］刺激过程中的表达模式，为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框（ORF），通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况，并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后的时序表达情况。【结果】 On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp，编码478个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为52.7 kD，理论等电点（pI）为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域（1~157 aa）和1个GTP-bd结构域（197~322 aa），不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%；基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支，二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达，且主要在T细胞亚群表达；经无乳链球菌感染和Poly （I:C）刺激后，On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化，且存在明显的时间依赖性。【结论】 On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域，进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能； On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后呈时间依赖性上调表达，表明ifi44基因作为重要的调节因子，参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。 相似文献
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为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5～9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD～66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。 相似文献