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1.
《经济动物学报》2016,(3)
根据Gen Bank中狐白细胞介素-2(IL-2)基因序列(AJ621188),设计合成1对引物,以水貂脾脏组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增水貂IL-2基因。序列分析表明:水貂IL-2基因长468 bp,编码155个氨基酸,其中含21个氨基酸的信号肽和134个氨基酸的成熟多肽。IL-2蛋白分子质量为17.84 ku,等电点为4.65,含有4个与二硫键形成有关的半胱氨酸,1个糖基化位点,成熟肽含有3个α螺旋,5个β折叠区,9个β转角。同源性分析发现,水貂IL-2基因序列与Gen Ban K发表的21种IL-2基因核苷酸序列同源性为2.9%~88.5%,氨基酸序列同源性为5.2%~80.6%。水貂与Gene Bank中21种动物的IL-2基因序列分析和系统进化树分析表明,IL-2基因存在种属特异性。水貂IL-2基因的成功克隆,为进一步研究水貂IL-2基因生物学活性和应用奠定基础。 相似文献
2.
根据GenBank中登录的犬白介素-18（IL-18）基因序列,设计了1对特异性引物。将北极狐外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导,用TRIzol裂解,提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增狐狸IL-18基因,连接pMD18-T载体,转化DH5d感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长590bp,含582bp的开放阅读框,编码193个氨基酸,与已知犬IL-18序列的同源性高达98．7％,氨基酸同源性为96．4％。 相似文献
3.
根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。 相似文献
4.
【目的】试验旨在对美洲水貂(Neovison vison)褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT)合成的限速酶5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(aralkylamine N-acetyltransferase, AANAT)基因进行克隆和生物信息学分析,为探究AANAT基因在水貂中的生物学功能提供参考。【方法】对水貂尾静脉采血后提取DNA,利用同源重组的方法克隆AANAT基因并分析其编码区(CDS)序列,推导成氨基酸序列后进行相似性比对及系统进化树构建,并对AANAT蛋白进行生物信息学分析。【结果】水貂AANAT基因序列长约1 631 bp, CDS区长504 bp,可编码167个氨基酸。水貂AANAT氨基酸序列与雪貂相似性最高(98.2%),系统进化树分析也显示其与雪貂亲缘关系最近。生物信息学分析结果表明,水貂AANAT蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,主要分布于细胞质中,有5个抗原结合位点为非分泌型蛋白,该蛋白含有多个磷酸化、糖基化等翻译后修饰位点。AANAT蛋白含有1个保守的N-酰基转移酶超家族结构域,该家族与哺乳动物的昼夜节律密切相关。AAN... 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2017,(12):70-74
为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和遗传演化关系,采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总RNA中扩增出TLR5基因的片段,经拼接获得全长编码区序列。序列全长2 577 bp,编码858个氨基酸,含172%的亮氨酸,并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明,该分子具有亲水性,由胞外区(具有LRR结构域)、跨膜区和胞内区(具有TIR结构域)组成,表现出典型的TLR家族结构特征;同源性分析结果显示,与蒙眼貂同源性最高,达97%以上,与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上,与其他物种同源性大都在70%以上。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础。 相似文献
6.
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
7.
根据GenBank中鸡白细胞介素18（inteleukin 18,IL-18）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）基因序列,克隆白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因并进行序列分析。结果显示：白来杭鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸,所获得的白来杭鸡IL-18基因与GenBank鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%。白来杭鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸,所获得的白来杭鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%-100%。IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性。IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点及3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点及4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果为进一步研究鸡IL-18、GM-CSF基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
8.
应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。 相似文献
9.
根据GenBank中登录的鸭IL-2基因序列设计并合成了1对特异性引物,以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出长度为360bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上。酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定结果表明,获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆。测序结果表明,该成熟蛋白基因由360个核苷酸组成,共编码119个氨基酸。克隆的鸭IL-2基因与GenBank上序列号为AY173028及AF294322的鸭IL-2基因的同源性高达99．4％。将目的基因克隆至真核表达载体pPICZαC上,构建了重组质粒pPICZαC—DuIL-2。酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了鸭IL-2基因。SDS-PAGE分析证实,鸭IL-2基因在毕市酵母（Pichiapastoris）中表达成功,表达的重组蛋白的分子质量约为14．3ku。 相似文献
10.
为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。 相似文献
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FAN Si-ning ZHANG Hai-ling ZHAO Jian-jun WANG Yang HU Bo LV Shuang MA Fan-shu LI Xin-tong LING Ming-yu ZHAO Hui LIAN Shi-zhen YAN Xi-jun 《中国畜牧兽医》2017,44(1):30-37
In order to obtain high purity of interleukin 4 (IL-4) protein,the specific primers were designed and synthesized according to the mink IL-4 gene sequence in GenBank. The IL-4 gene was amplified by RT-PCR using total RNA of the lymphocyte isolated from the peripheral blood that induced by phytohemagglutinin (PHA). The length of IL-4 gene sequence was 399 bp which encoded 132 amino acids. Phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequences homology between mink and ferret was 99.2%,90.0% with Ailuropoda melanoleuca and Canis familiaris. Prokaryotic expression vector pProEX-HTb-IL-4 was constructed and induced by IPTG. The recombinant protein of 15 ku was isolated by SDS-PAGE and detected by Western blotting. Highly purified recombinant protein of mink IL-4 was obtained by His-Trap HP affinity columns method. This research laid the foundation for the further studies on the biological function of mink IL-4 gene. 相似文献
12.
为研制水貂阿留申病核酸疫苗,应用重叠延伸PCR技术去除ADV VP2基因中编码428~446位氨基酸的核苷酸序列,与pc DNA3.1(~+)载体连接,构建全基因突变重组质粒pc DNA3.1-ADV-428,在此基础上,截去编码487~501位氨基酸的核苷酸序列,构建全基因突变重组质粒pc DNA3.1-ADV-428-487。将构建的重组质粒经肌肉注射免疫小鼠,应用间接ELISA法检测接种后14、28、42、56 d抗ADV抗体水平;流式细胞术检测接种后第42天小鼠脾细胞CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群。结果显示,小鼠接种质粒后CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群数量均明显增加,第42天抗ADV抗体水平达峰值。本试验通过对ADV全基因突变重组质粒的免疫原性进行分析,为水貂阿留申病核酸疫苗的研制提供了参考。 相似文献
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猪白细胞介素-4基因的克隆与表达 总被引：1，自引：2，他引：1
利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础. 相似文献
14.
运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段. 相似文献
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为研究杂交猪白细胞介素-18(IL-18)蛋白的结构与功能,将杂交猪外周血淋巴细胞体外刺激培养后,提取淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR扩增的方法,获得IL-18全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,测得核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的同源性在99.0%～99.8%之间,推到氨基酸同源性在99.7%～100%之间;然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a/IL-18。将阳性重组质粒转化进RossettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0mM、诱导温度37℃、诱导时间为3-4h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为35Ku,表达量约为38%,主要存于包涵体中,具有良好的免疫学活性。 相似文献
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本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。 相似文献
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为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用,以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增出N基因片段,利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析;将N基因克隆连接到pColdⅠ原核表达载体上,经PCR、双酶切鉴定及序列测定后,得到重组质粒pColdⅠ-N,将pColdⅠ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示,分离株E11105N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%;系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近;分离株E11105N基因所编码蛋白不存在跨膜区;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占20.33%和63.41%;预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中,分子质量约为16.7ku;Western blot结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别,显色后条带约为16.7ku,与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。 相似文献