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试验旨在研究猪圆环病毒不同佐剂疫苗的制备及其对免疫原性的影响。将去除信号肽的PCV2（porcine circovirus type 2,PCV2）Cap蛋白基因连接在pET-28a载体上,进行诱导表达,用脱氧胆酸钠（DOC）和低浓度尿素对表达产物进行溶解,制备氢氧化铝胶体佐剂、脂质体佐剂、弗氏佐剂、白油佐剂、蜂胶佐剂,并与纯化的PCV2-Cap蛋白混合制成亚单位疫苗,以商品化的灭活疫苗作为阳性对照,免疫小鼠,并使用ELISA方法检测动物血清中抗体及细胞因子含量的变化,评估其免疫保护效果。结果显示,表达产物以包涵体的形式存在,使用DOC溶解包涵体可省略蛋白复性步骤,且纯化方法简单,获得纯度较高的衣壳蛋白;ELISA检测结果表明PCV2-Cap蛋白能诱导产生特异性较高的抗体;水系佐剂制备的亚单位疫苗具有较高的免疫活性,为亚单位疫苗的商品化提供重要的数据支持。 相似文献
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泰山松花粉多糖对PRRSV GP5亚单位疫苗免疫增强作用的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国预防兽医学报》2017,(9)
为研究泰山松花粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的免疫增强作用,本研究以原核表达的高致病性PRRSV GP5蛋白为抗原,添加不同剂量的天然提取的泰山松花粉多糖(TPPPS)作为免疫佐剂配制PRRSV亚单位疫苗。选取72只SPF昆明小鼠随机分为6组(Ⅰ-Ⅵ),12只/组。Ⅰ组免疫纯化的GP5亚单位疫苗,Ⅱ-Ⅳ组分别免疫不同浓度的TPPPS(20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mL)佐剂GP5亚单位疫苗,V组免疫弗氏不完全佐剂GP5亚单位疫苗,VI组注射PBS;1周后各组均加强免疫1次,加强免疫后,每周每组随机挑选3只小鼠采集外周血,分别检测小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞亚群比例、T淋巴细胞转化率和细胞因子的含量,评价TPPPS对PRRSV-GP5蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。结果显示,所有疫苗免疫组小鼠的上述免疫指标比对照组均有显著提高,而添加TPPPS和弗氏佐剂的疫苗组各项指标均显著高于单独GP5蛋白免疫组。3个浓度的TPPPS佐剂中,60 mg/mL浓度的免疫增强效果最显著。本研究表明,重组表达的PRRSV GP5蛋白能够诱导动物机体显著的免疫应答,TPPPS佐剂对PRRSV GP5蛋白呈现显著的免疫增强效果。本研究为研制PRRSV亚单位疫苗提供了参考。 相似文献
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猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗.30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时设攻毒对照与空白对照,首免后21 d加强免疫,二免后14 d用PCV2 JS株攻毒.铝胶佐剂亚单位疫苗免疫猪体后产生了PCV2特异性中和抗体.猪α干扰素佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪.攻毒对照组的4只仔猪攻毒后全都产生了病毒血症,并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症,添加猪α干扰素亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症.综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果,猪α干扰素可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应,提高PCV-2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果. 相似文献
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盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较 总被引：1，自引：0，他引：1
为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(6):1135-1139
选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。 相似文献
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为研究不同免疫增强剂对禽戊型肝炎病毒（aHEV）ORF2蛋白的免疫效果影响，研究通过大肠杆菌原核表达系统表达aHEV ORF2蛋白，纯化后与弗氏佐剂按1∶1等体积混合制备亚单位疫苗。将90只1日龄SPF雏鸡随机分成6组，每组15只。ORF2蛋白组单纯免疫YT-ORF2蛋白，ORF2蛋白+弗氏佐剂组免疫YT-ORF2蛋白+弗氏佐剂，AB101组免疫YT-ORF2蛋白+弗氏佐剂+AB101,AB106组免疫YT-ORF2蛋白+弗氏佐剂+AB106,AB506组免疫YT-ORF2蛋白+弗氏佐剂+AB506，空白对照组免疫生理盐水，分别在21、28、42日龄三次免疫SPF鸡。采用ELISA和间接免疫荧光检测不同免疫组SPF鸡的aHEV抗体水平，通过流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞水平，荧光定量PCR检测IL-2、IL-4、IFN-γ 3种细胞因子表达情况，并测定体重和器官发育指数。结果显示：原核表达获得分子量为72 ku的ORF2蛋白，AB106组产生的抗体水平极显著高于其他各组（P<0.01）,AB106和AB506免疫增强剂可引起CD4+和CD8+T细胞比重显著增加并上调I... 相似文献
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对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株（2G9,3E5）可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗（3E5）包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。 相似文献
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The study was aimed to prepare vaccines with different adjuvants,and research its effects on immunogenicity.The PCV2 Cap gene with its signal peptide removed was connected to pET-28a vector,and then was induced to express,using sodium deoxycholate（DOC）and low concentration of urea to dissolve the inclusion body.Different adjuvants,such as alum-based adjuvants,liposome adjuvants,propolis adjuvants,white oil adjuvants and Freund adjuvant were prepared,together with protein purified to make up subunit vaccines,and commercial inactivated vaccine as positive control,immuning mice,and ELISA method were used to detect changes in concentrations of animal serum antibody and cytokines,evaluated the immune protective effect.Results showed that the expression product in the form of inclusion body,using the DOC could omit dissolving inclusion body protein renaturation steps,and the purification method was simple,the capsid protein obtained had high purity.ELISA assays showed that PCV2-Cap had good immunogenicity.And we found that the water system adjuvants had high immune activity,this could provide important previous experimental data for the commercialization of the subunit vaccine. 相似文献
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白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用 总被引：1，自引：0，他引：1
犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。 相似文献
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将鸡新城疫、禽流感（H9亚型,SY株）二联灭活疫苗与市售同类对照苗分不同剂量皮下注射接种30日龄SPF鸡,免疫后定期采血,分离血清,通过检测血清中ND和AI的HI抗体水平比较各组鸡抗体产生期、抗体高峰及免疫持续期,并进行不同血凝抗原检测HI抗体结果的对比。试验鸡血清样品检测结果显示,免疫鸡抗体产生期为免后2周内,免后8周和5周ND和AI的HI抗体滴度分别达到峰值,抗体至少可持续28周以上,两种灭活苗之间免疫效果基本相当。 相似文献
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选择17头28日龄的CSFV和PRRSV抗体均为阴性的仔猪,于试验的第1天和第14天分别对其进行猪瘟耐热保护剂活疫苗（兔源）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征Nsp2A1882—2241弱毒疫苗免疫。在免疫后的第28、42天采集外周血液,分析特异性抗体表达量和外周血T淋巴细胞表型的变化,评估猪瘟免疫对猪繁殖与呼吸综合征免疫的影响。结果显示,在CSF免疫后第28、42天,CSFV高抗组中的CD4^＋、CD4^＋／CD8^＋、CD4^＋CD8^＋和CD4-CD8数目均比CSFV低抗组高,CD3^＋和CD8^＋细胞数量比CSFV低抗组低;PRRS高抗组中,CD4CD8-细胞含量高于PRRS低抗组;在CSF免疫后第28天,CSFV抗体产生较高（阳性比率为73．33％）,PRRSV抗体产生较低（阳性比率仅为6．67％）。在CSF免疫后的第42天,CSF高抗组中PRRSV抗体阳性比率较CSF低抗组高8．33％。结果表明,CSFV特异性抗体产生高时能增加PRRSV特异性细胞免疫应答,增加CD4^＋细胞、CD4^＋CD8^＋细胞数量,提高机体免疫水平。CD3＋和CD4CD8-细胞应答作用值得重视。 相似文献
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猪囊虫病基因工程疫苗的体液与细胞免疫反应 总被引：2，自引：0，他引：2
为了探讨以 Ｉ Ｓ Ｃ Ｏ Ｍ 作佐剂的猪囊虫病基因工程疫苗的免疫机理,对其诱导的体液免疫与细胞免疫反应进行了测定。用上述疫苗免疫 ９ 头试验猪,采用间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测体液免疫反应及通过淋巴细胞转化试验、 Ａ Ｎ Ａ Ｅ染色试验、 Ｅ玫瑰花环形成试验等检测细胞免疫反应;用该疫苗和铝胶苗分别免疫昆明小鼠各 ２０ 只,分别检测体液免疫反应和 Ｔ 淋巴细胞抑制／杀伤亚群的动态变化。体液免疫的检测结果显示,免疫后 ７ 天即出现抗体,２１ 天后抗体全部转阳,持续的时间不少于 １９３ 天,效价明显高于铝胶苗;细胞免疫检测结果显示,免疫猪外周血 Ｔ淋巴细胞转化率、 Ａ Ｎ Ａ Ｅ＋ 细胞和粗粒型 Ａ Ｎ Ａ Ｅ＋ 细胞、 Ｅ Ｒ Ｆ Ｃ和 Ｅａ Ｒ Ｆ Ｃ细胞显著升高,免疫小鼠 Ｔ淋巴细胞抑制／杀伤亚群显著升高;与铝胶苗及对照组比较,差异极显著。以上结果表明猪囊虫病基因工程疫苗可同时激发动物的体液免疫和细胞免疫反应,增强了机体的免疫调节功能及杀伤性 Ｔ 淋巴细胞功能。 相似文献
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跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团（Ii-Key）在此过程中发挥重要作用。为了研究Ii-Key携带异种病毒抗原表位能否有效增强机体的免疫应答,本试验首先构建Ii-Key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位（aa197-209）和新城疫病毒HN肽表位（aa345-353）的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32α原核表达载体,转化E.coli Rosetta诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALB/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,Ii-Key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。通过将嵌合体基因导入pmCherry-C1真核表达载体与pEGFP-N1-MHCⅡα共转染293T细胞,结果表明Ii-Key/VP2/HN嵌合体与VP2/HN和空载体蛋白在细胞内均呈现弥散状,与MHCⅡ类分子共定位无明显差异。综上所述,Ii-Key能够携带异种病毒串联抗原表位有效增强免疫应答,其增强机制还有待于进一步研究。 相似文献
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为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。 相似文献
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犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。 相似文献