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1.
[目的]克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因,并对其进行功能研究。[方法]采用RACE技术克隆基因c DNA序列,实时荧光定量PCR检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式,花序浸泡法转化拟南芥,并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行GFP荧光检测。[结果]克隆到1个871 bp的GPX基因全长c DNA序列,命名为Pm GPX6。Pm GPX6包括513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸残基。Pm GPX6蛋白与油松Pt GPX蛋白同源性达95%。Pm GPX6在马尾松根中高表达,茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下,Pm GPX6在根、茎、叶中的表达量均在第15天达到最大,随后出现下降趋势。过表达Pm GPX6与野生型拟南芥植株在正常水分条件下表型与根长差异不大,但在干旱胁迫下,转基因植株根系更长。转基因拟南芥根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光,表明Pm GPX6基因能高效表达。[结论]推测Pm GPX6可能参与马尾松干旱胁迫应答。 相似文献
2.
《林业科学》2021,(9)
【目的】对2年生马尾松幼苗进行不同浓度IAA喷施处理,结合生理生化、形态解剖结构及转录组水平变化等综合分析,揭示外源IAA对马尾松苗期茎干次生生长的影响机制,为阐明马尾松苗期茎干次生生长的分子调控机制奠定基础,可以为培育速生高产的马尾松新品系提供一定的理论参考。【方法】对2年生马尾松幼苗进行不同浓度IAA(0、1、50、100 mg·L-1)喷施处理,处理160天后进行生长指标、解剖结构、生理生化指标的测定;通过高通量转录组测序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行GO和KEGG功能分析。【结果】IAA处理对2年生马尾松的地径、细胞生长(木质部、韧皮部厚度以及木质部细胞层数)、木材主要成分(木质素、纤维素及半纤维素含量)及内源激素含量(生长素、赤霉素及油菜素内酯)具有显著的促进作用(P0.05);通过Illumina测序技术对对照组和IAA处理的6个cDNA文库进行测序,最终得到IAA处理后差异表达基因778个(包括482个上调表达基因和296个下调表达基因),GO分析表明这些差异基因主要富集于细胞成分、分子功能和生物过程中共计22个类别,KEGG分析表明它们参与了64种不同的途径,并筛选出与马尾松次生生长相关的差异表达基因(BRL1、GASA6、CAD和CESA2等)。【结论】IAA处理能够改变内源激素含量,促进细胞分裂,增加木质素、纤维素和半纤维素积累,从而促进马尾松茎干的次生生长。 相似文献
3.
【目的】花青素苷是梅花花色形成的重要色素,R2R3-MYB是花青素苷合成调控的关键转录因子。从梅花中分离出1个R2R3-MYB调控因子PmMYB1,通过分析其序列特征并转入烟草进行功能鉴定,为探明梅花花青素苷合成调控机理及今后梅花花色分子育种奠定基础。【方法】根据梅花基因组数据设计引物,采用RT-PCR方法从梅花花瓣中分离PmMYB1基因,利用DNAMAN软件预测氨基酸序列,通过多序列比对和系统进化树构建分析其保守序列并进行功能预测,通过构建表达载体将PmMYB1基因转入烟草,分析转基因烟草的表型及花青素苷含量的变化,并利用实时荧光定量RT-PCR技术测定该基因及烟草内源花青素苷合成通路基因在转基因植株不同器官中的表达量,综合分析以上数据鉴定PmMYB1基因的功能。【结果】从梅花中分离得到全长为729 bp具有完整编码区的PmMYB1基因序列,该序列编码242个氨基酸。序列分析表明该蛋白具有保守的MYB结构域及花青素苷调控MYB蛋白特征基序,并且含有与bHLH转录因子相互作用的保守基序,可能需要bHLH蛋白协同表达共同完成花青素苷的合成调控。多序列比对和进化分析结果显示PmMYB1与其他已鉴定功能的花青素苷调控MYB蛋白有很高的同源性,其中与樱桃李的PcMYB10和欧洲甜樱桃的PaMYB10一致性分别为92%和91%。转基因烟草试验表明过表达PmMYB1基因显著提高了转基因植株花冠中花青素苷的含量(P0.05),使其花冠颜色明显加深,实时荧光定量RT-PCR试验结果表明PmMYB1基因在转基因植株花中表达量高于叶中,过表达PmMYB1基因明显上调了烟草花中7个内源花青素苷合成通路结构基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT及2个调控基因NtAn1a和NtAn1b的表达量。【结论】在烟草中过表达PmMYB1基因能够显著上调转基因植株花中内源花青素苷合成通路结构基因和调控基因的表达,从而促进了其花中花青素苷的积累并导致花色加深,表明该基因在花青素苷合成过程中起重要调控作用。 相似文献
4.
【目的】解析光合产物在马尾松幼苗植株中的运输和分配规律,揭示马尾松生产力形成过程,为探讨不同环境干扰下马尾松光合产物分配过程的变化提供参考依据。【方法】采用 13 C同位素脉冲标记法,对1.5年生马尾松幼苗进行标记,标记结束后第0、2、5、17、24、72、120、168、216和 360 h ,按不同部位对马尾松幼苗进行全收获取样,测定 13 C含量,以监测近期合成的光合产物在马尾松幼苗中的运输和分配规律,同时测定光合产物全碳、非结构性碳水化合物(NSC)在各个器官的积累量。【结果】1)标记的光合产物在针叶中合成后,向各库器官的运输量随着时间延长由多逐渐减少,具体表现为标记结束后0~24 h内最多,24~216 h逐渐减少,216 h之后运输完成,且59%以上标记的光合产物在0~24 h内运输到各库器官。2)光合产物运输趋于稳定后,在各器官的分配大小依次为1年生叶>当年生叶>根>茎干>1年生枝>当年生枝,与生物量的分配大小一致,但与库活力大小不同,其库活力依次为当年生叶>当年生枝>1年生叶>根>1年生枝>茎干。3)各器官全碳和NSC积累量的分配与近期合成光合产物的分配大小一致,依次为1年生叶>当年生叶>根>茎干>1年生枝>当年生枝。【结论】马尾松幼苗光合产物运输速率大于0.1 m ·h -1 ,59%以上标记的光合产物在合成后的0~ 24 h 内完成向各个库器官输出。新合成的光合产物在各器官中的积累量表现为功能器官(叶和根)居多,这一分配规律有利于马尾松幼苗阶段的生长。 相似文献
5.
【目的】MYB转录因子是调控植物木质素合成和次生壁形成的重要转录因子之一。本文分离克隆到一个与拟南芥AtMYB20高度同源的橡胶树MYB转录因子基因HbMYB20,并在拟南芥中对其功能进行研究,以期了解其在橡胶树木质素合成和次生壁发育的分子调控中的作用,为橡胶树木材形成的分子调控机制研究及其遗传改良奠定基础。【方法】采用 blast分析从树皮转录组中筛选出与拟南芥 AtMYB20序列同一性较高的橡胶树 MYB 基因HbMYB20;设计 ORF区特异性引物,以树皮 cDNA 为模板进行扩增得到该目的基因 cDNA 序列。实时荧光定量PCR检测该基因在橡胶树叶片、胶乳、茎干以及木质部与韧皮部的相对表达量。构建 HbMYB20过表达植物载体,使用农杆菌蘸花法转化拟南芥,获得该基因过表达转基因株系。采用乙酰溴法和间苯三酚染色法,分析转基因、野生型拟南芥茎的木质素含量以及木质素在拟南芥茎基部横截面中的分布。对转基因、野生型拟南芥茎基部横截面切片进行甲苯胺蓝染色,并测量分析导管、木质纤维和维管束间纤维细胞的细胞壁厚度。最后,采用实时荧光定量PCR分析转基因及野生型拟南芥木质素和纤维素合成相关酶基因的表达。【结果】克隆得到1个橡胶树 MYB 转录因子基因 HbMYB20,该基因开放阅读框( ORF)为927 bp,编码309aa 的蛋白,氨基酸序列分析显示,HbMYB20与AtMYB20/43和 AtMYB85/42同源性较高,属 R2R3MYB转录因子 G8亚组成员。表达分析显示 HbMYB20在橡胶树茎干和木质部中高表达,胶乳中表达最低。对 HbMYB20过表达拟南芥分析显示,该基因在3个转基因株系中均表达;相对野生型拟南芥,转 HbMYB20拟南芥植株生长抑制,木质部和维管束间纤维的木质素染色面积较少、染色程度变浅,茎的木质素含量和木质纤维、导管及维管束间纤维的细胞壁厚度均显著低于野生型;同时转基因株系中木质素合成关键酶基因4CL1和 CCoAOMT的表达量以及纤维素合成关键酶基因 CesA8的表达显著下调。【结论】橡胶树 MYB转录因子 G8亚组成员 HbMYB20,在茎和木质细胞中高表达。拟南芥中过表达 HbMYB20导致转基因植株的矮小,细胞壁变薄,阻碍木质部中木质素的合成和积累,同时木质素和纤维素合成相关酶基因的表达显著下降。由此推测 HbMYB20对拟南芥的木质素和纤维素合成都具有负调控作用,可能是1个橡胶树次生壁发育的负调控因子。 相似文献
6.
《林业科学》2017,(9)
【目的】植物促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在响应生物与非生物胁迫中发挥重要作用。本研究通过分析桑树(川桑)B家族MAPK基因MnMAPK5的亚细胞定位和启动子活性,并将其转入拟南芥中进行过表达研究,探讨MnMAPK5在逆境胁迫下的作用机制。【方法】将MnMAPK5的上游启动子连接到p BI121载体上,通过花粉介导法转入拟南芥中,经高温、低温、NaCl和PEG处理后进行GUS染色分析。通过构建过表达载体,将MnMAPK5转化到拟南芥中,用T3转基因植株进行抗逆境胁迫分析。【结果】MnMAPK5基因的编码蛋白定位于细胞质和细胞核中。在拟南芥中检测MnMAPK5启动子驱动的GUS活性的结果显示,MnMAPK5启动子活性受到了高温、低温、高盐和干旱胁迫的诱导。在高盐、干旱、低温和H_2O_2处理条件下,过表达MnMAPK5抑制了转基因拟南芥的萌发和生长。在盐胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因植株中的MDA含量和POD活性,降低了CAT活性、可溶性糖含量和H_2O_2含量;在干旱胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的MDA和H_2O_2含量,降低了CAT和POD活性;在低温下,转基因拟南芥相比野生型植株表现出更低的CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量;在氧化环境胁迫下,转基因拟南芥的MDA含量显著高于野生型拟南芥,而脯氨酸含量和可溶性糖含量要低。此外,在各个胁迫环境条件下,AtPOD、AtCAT和AtRD22等胁迫相关基因的表达量在转基因植株低于野生型拟南芥。【结论】MnMAPK5启动子在转基因拟南芥中的活性受到了不同非生物胁迫的诱导。过量表达MnMAPK5降低了拟南芥对非生物胁迫的抵抗能力,表明MnMAPK5在逆境胁迫下起着负调控作用。 相似文献
7.
《林业科学》2016,(7)
【目的】研究经历多年生长和对复杂自然环境适应后,嫁接的8年生转基因741杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索成年树木Bt毒蛋白的运输部位、运输量、运输的方向性和积累等规律。【方法】利用转Bt Cry1Ac基因741杨与未转基因741杨互为砧木和接穗进行嫁接,在自然条件下生长8年后,对2种不同嫁接方式杨树砧木和接穗的Bt Cry1Ac基因进行PCR检测和验证,利用ELISA技术对成年嫁接杨树的不同部位、不同组织进行毒蛋白含量检测。【结果】Bt Cry1Ac基因的PCR检测结果表明,Pb29/741嫁接杨中接穗部分和741/Pb29嫁接杨中砧木部分均扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,其余非转基因部分和阴性对照未扩增出特异性条带,证明Bt基因在嫁接杨树的转基因部分稳定存在,未发现外源基因丢失现象。ELISA检测表明,2种不同嫁接方式处理的741杨砧木和接穗的叶片、韧皮部、木质部和髓中均检测到Bt毒蛋白存在,证明Bt基因在8年生转基因嫁接741杨中稳定表达,且Bt毒蛋白可以在成年嫁接741杨的砧木和接穗间运输。Pb29/741成年株中,根部为非转基因部分,地上枝干部分为转基因组织,地上转基因组织能够表达Bt毒蛋白,其含量呈现出树冠外侧向内侧逐渐升高,树干部分向下又逐渐降低的趋势,且可以向根和树干基部非转基因组织运输和积累,以韧皮部运输为主。741/Pb29成年株中,根部为转基因部分,地上枝干为非转基因组织,根和树干基部组织也可以表达Bt毒蛋白,且可以由根部和干基部由枝干向树冠外侧运输并积累,以韧皮部运输为主;非转基因枝干部分呈现出树干向上逐渐降低,树冠内侧向外侧逐渐升高的趋势。【结论】尽管嫁接方式不同,嫁接的转基因杨树经历8年生长和复杂自然环境的影响和适应后,Bt毒蛋白的运输都呈现出由转基因组织向非转基因组织运输现象,毒蛋白含量呈现出类似由源向库运输和积累的趋势。转基因杨树可以通过传统嫁接方式在生产上应用,以提高转基因林木的生态安全性。 相似文献
8.
【目的】B-box锌指蛋白( BZF)在植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要的调控作用。强光胁迫对竹子的生长发育有着重要的影响,通过分析毛竹 BZF 基因编码蛋白的分子特征及组织表达模式,研究过量表达PeBZF4转基因植株的荧光动力学参数变化,以期为揭示竹子 BZF 基因对强光的应答与调节机制提供参考。【方法】采用同源基因比对的方法直接从 BambooGDB中获得毛竹 BZF基因同源序列,利用专用软件和在线公共平台分析基因及其编码蛋白序列,查找各种作用元件,预测蛋白功能结构域,分析蛋白的亲水性/疏水性。采用实时定量 PCR技术分析基因在不同组织中的表达情况以及强光(1200μmol·m －2 s －1)和黑暗处理后基因在叶片中的表达变化。构建 PeBZF4基因的过量表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,直接观察转基因植株表型,利用IMAGING-PAM 荧光仪测定其叶绿素荧光参数。【结果】从毛竹数据库获得4条不同的 BZF 基因同源序列,编码4个不同的锌指蛋白,分别命名为 PeBZF1,PeBZF2,PeBZF3和 PeBZF4。4个基因中均具有光应答顺式作用调控元件 ACE和 G-box,但它们所含光应答元件却有所差异,PeBZF1中有 MNF1和 Sp1,PeBZF2中有 I-box,Sp1和 boxⅡ, PeBZF3和PeBZF4中有GT1-motif,MNF1和Sp1。4个基因所编码的蛋白都具有2个B-box结构域和CHC3H2锌指结合域,属于B-box型锌指蛋白。在根、茎、叶片和叶鞘中的表达4个基因存在着明显差异,其中PeBZF1和PeBZF3在叶片中的表达丰度最高,PeBZF2和 PeBZF4在叶鞘中的表达丰度最高。强光处理后 4个基因的表达均受到抑制,且随着光照时间的延长 PeBZF2和 PeBZF3的表达呈逐渐下降趋势,而 PeBZF1和 PeBZF4的表达却在光照1 h时比0.5 h时略微上调,随后迅速下降;黑暗对 PeBZF1,PeBZF2和 PeBZF3的表达有明显抑制作用,而 PeBZF4的表达却显著上调,约是对照的3.2倍。过量表达 PeBZF4的转基因植株光系统Ⅱ的实际光合效率 Y(Ⅱ)和非光化学猝灭( NPQ)值都比野生型有不同程度的提高。【结论】毛竹中有4个不同B-box型锌指蛋白基因,其表达为组成型,强光和黑暗处理4个基因的表达变化表明它们参与了光胁迫的应答调节。过量表达 PeBZF4基因能够提高转基因植株的 Y(Ⅱ)和 NPQ值,证明 PeBZF4能够增强其热耗散能力,提高强光下的光合效率。因此,BZF 可能与竹子抵抗强光胁迫有关。 相似文献
9.
【目的】研究华山松大小蠹冷休克结合蛋白基因和表达特性,为揭示冷休克结合蛋白基因在华山松大小蠹适应性、耐寒性分子机制奠定基础。【方法】从华山松大小蠹c DNA转录组中克隆获得的扩增序列经Blast同源比对鉴定基因,应用MEGA软件构建系统发育树和实时荧光定量PCR分析冷休克结合蛋白基因在不同低温环境与时间序列的表达特性。【结果】从华山松大小蠹cDNA转录组序列克隆出1条华山松大小蠹冷休克结合蛋白基因序列,命名为DarmCSP。Blast比对结果显示,华山松大小蠹DarmCSP与黑山大小蠹CSP最为相似,相似性达92%。经实时荧光定量PCR分析华山松大小蠹冷休克结合蛋白基因DarmCSP在越冬期间(9月—次年3月)的表达特性,发现DarmCSP在越冬期间相对表达量呈上调趋势,DarmCSP在1月的相对表达量是9月的4.26倍,3月的2.90倍。越夏成虫(7月)和越冬幼虫(1月)DarmCSP相对表达量均呈现上调表达。华山松大小蠹幼虫在-10℃1~24 h低温胁迫下,DarmCSP的相对表达量随处理时间的延长而升高,24 h时相对表达量达到最大值,而在-2、-4、-6和-8℃低温下胁迫12 h,相对表达量达到最大值,这说明0℃~-10℃低温胁迫均能诱导华山松大小蠹DarmCSP的表达。同时,越夏成虫在4℃~-6℃低温胁迫下DarmCSP也呈上调表达,但相对表达量小于越冬幼虫。【结论】华山松大小蠹冷休克结合蛋白基因DarmCSP的表达受低温诱导,参与了华山松大小蠹对低温适应过程,这对进一步研究华山松大小蠹冷休克结合蛋白信号转导途径和作用机制具有重要的价值。 相似文献
10.
【目的】通过比较转水通道蛋白基因Pt PIP1;3(Gen Bank登录号:MN795092 ptopip1.3)的84K杨与野生型植株的光合作用对干旱及复水的响应,分析该过程的限制因素,以期深入了解水通道蛋白PIP1在干旱胁迫及复水过程中对CO_2导度的调节作用及其对光合作用的影响。【方法】以杂交杨84K野生型及转Pt PIP1;3基因植株为研究对象,进行重度干旱胁迫(土壤含水量达到田间持水量的35%)及复水处理,测定气体交换及叶绿素荧光各个指标,计算叶肉导度(g_m)等参数,进而分析水通道蛋白在干旱条件及复水后对CO_2导度和光合作用的调节作用。【结果】转Pt PIP1;3基因84K杨在正常浇水下净光合速率(P_n)、气孔导度(g_s)和蒸腾速率(Tr)显著高于84K野生型。干旱胁迫至第6天,野生型和转基因植株光合作用都开始下降,且转基因植株光合作用下降速度更快,至第7天降到野生型同样的水平。干旱处理的第7～10天,转基因植株和野生型植株的g_s、g_m和P_n均显著低于各自对照(正常浇水植株),光化学淬灭(q_P)、光系统Ⅱ实际光化学效率(Ф_(PSⅡ))、电子传递速率(J_(flu))、最大羧化速率(V_(cmax))和最大电子传递速率(J_(max))也显著降低,此时2种植株的光合作用都主要受到叶肉导度的限制。在复水的3天过程中,转基因植株的光合作用恢复速度更快,而且叶绿素荧光参数能够恢复到正常水平,期间光合作用主要受到叶肉导度的限制;而野生型植株的光合参数以及叶绿素荧光参数都未完全恢复,其光合作用除了受到叶肉导度的限制外,还受到光合作用中生物化学过程的限制。【结论】叶肉导度是转水通道蛋白基因及野生型84K杨干旱胁迫和复水过程中光合作用的主要限制因素。在干旱胁迫后水通道蛋白基因过表达的转基因杨树光合作用恢复迅速,包括光系统Ⅱ性能的恢复,这有助于杨树适应自然界中经常发生的阶段性干旱胁迫。 相似文献
11.
【目的】异源表达是植物蛋白功能验证和分子育种的重要手段,而密码子是异源基因高效表达的重要因素,对马尾松转录组基因编码区密码子偏好性分析可以为马尾松分子育种提供一定的理论支持。【方法】利用CodonW、EMBOSS密码子分析软件对马尾松转录组进行密码子参数分析和密码子偏好性分析,根据中性绘图、ENc-GC3s、偏倚性分析推测马尾松密码子偏好性的主要形成原因。通过比较高低表达基因样本同义密码子相对使用度(RSCU)筛选马尾松最优密码子,通过密码子使用频率比值分析马尾松与拟南芥、烟草、欧洲山杨、大肠杆菌、酿酒酵母的密码子偏好性差异。【结果】马尾松转录组编码序列(CDS)密码子平均GC含量为44. 95%,密码子第3位GC含量为38. 95%,尤为偏好A/T。高、低表达基因样本统计分析表明,马尾松转录组RSCU差异较小,筛选出TTA、CAA、TGT、GGT等27个密码子可作为马尾松的最优密码子。中性绘图、ENc-GC3s关联分析以及偏倚分析表明,马尾松密码子偏好性的形成可能主要受突变影响,其次受自然选择等多重因素共同影响。密码子使用频率分析表明马尾松密码子偏好性与烟草、拟南芥和欧洲山杨相比差异较小,与大肠杆菌差异最大,与酿酒酵母差异小于大肠杆菌。【结论】马尾松偏好第3位为A/T的密码子,筛选出27个最优密码子,其中25个密码子第3位为A/T。马尾松密码子使用偏好性形成主要受突变影响,其次受自然选择等多重因素共同影响。烟草可以作为马尾松基因异源表达的优选植物生物体,而微生物中酿酒酵母可能优于大肠杆菌。 相似文献
12.
《林业科学》2017,(4)
【目的】探讨干旱胁迫下马尾松幼苗针叶内源激素含量变化与挥发性物质释放规律,为马尾松抗逆生理研究和育苗提供科学依据。【方法】采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS),对不同干旱胁迫处理的马尾松幼苗针叶挥发性物质进行鉴定,并采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(LC-MS/MS)测定其内源激素含量。【结果】GC-MS鉴定出13种挥发性物质,属于萜类、醛类、醇类和酯类化合物,其中9个化合物确定为萜类,相对含量较高的物质是α-蒎烯、石竹烯和α-水芹烯。干旱胁迫时马尾松幼苗针叶单萜类相对含量先降低后逐渐升高,倍半萜类相对含量则先升高再逐渐降低,干旱胁迫明显诱导针叶单萜类含量增加;马尾松幼苗针叶脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)含量随着干旱胁迫程度加大呈明显增加趋势,赤霉素(GA)和生长素(IAA)含量随着干旱胁迫程度加大呈逐渐降低趋势。【结论】HS-SPME可作为干旱胁迫下马尾松幼苗针叶挥发性物质提取的有效手段,GC-MS适合于马尾松幼苗针叶挥发性物质的识别;干旱胁迫时马尾松幼苗针叶含有丰富的单萜和倍半萜,针叶通过调节单萜与倍半萜比例响应干旱胁迫;干旱胁迫时马尾松幼苗针叶通过内源激素相互协调来适应干旱逆境,其中ZT和ABA是其重要的干旱胁迫信号激素。 相似文献
13.
14.
《林业科学》2017,(9)
【目的】基于前期鹅掌楸生长性状与EST-SSR分子标记关联分析结果,克隆分离与鹅掌楸生长性状相关联的SSR位点相对应的基因,通过分析其序列特征、结构特征、与其他物种同源基因的亲缘关系和表达特性,初步了解该基因在鹅掌楸生长发育过程中的作用。同时,利用遗传转化技术对分离的基因进行功能研究,以期为鹅掌楸生长发育的分子机制研究及功能基因挖掘奠定基础。【方法】以鹅掌楸叶芽为材料,借助其叶片转录组数据库,采用RT-PCR和RACE技术克隆分离与鹅掌楸生长性状相关联的642号位点对应的EST序列相关基因,对其进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在鹅掌楸花芽、盛花期的叶芽、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊中的相对表达量。利用Gateway技术构建该基因的植物过表达载体,使用农杆菌GV3101介导的花絮浸染法转化拟南芥,获得T2代转基因植株,直接观察转基因植株表型。【结果】克隆获得与鹅掌楸生长性状相关联的642号位点相对应的基因,该基因全长1 968 bp(GenBank登录号:KU883608),开放阅读框为1 269 bp,编码422个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列含有1个典型的DHHC-CRD结构域,属于DHHC型锌指蛋白家族成员,与其他植物预测的蛋白质棕榈酰基转移酶(PAT)高度相似,并根据与NCBI中拟南芥PAT基因的比对结果,将其命名为LcPAT8。组织表达分析表明,LcPAT8基因在鹅掌楸花芽、叶芽等6个组织中均有表达,在雌蕊中表达量最高,花瓣和叶片中的表达量高于叶芽和花芽,而在雄蕊中的表达量最低。利用Gateway技术,成功构建了鹅掌楸LcPAT8基因的植物过量表达载体,获得T2代转基因拟南芥。与野生型拟南芥相比,过表达LcPAT8基因的拟南芥植株的莲座叶片数目以及抽薹时间没有发生明显变化,而野生型植株大部分角果成熟、叶片枯黄掉落时,转基因植株依然生长旺盛,叶片鲜绿并且还有大量花絮,在野生型植株干枯死亡后,转基因植株还有大量侧枝生长、开花。【结论】鹅掌楸LcPAT8基因在雌蕊中表达量最高,其次是花瓣,可能参与花瓣的扩展、心皮及胚的发育;在拟南芥中过表达LcPAT8基因,明显延长了植株的生长期。因此,鹅掌楸LcPAT8基因可能在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。 相似文献
15.
【目的】细胞扩展蛋白(EXP)作为植物细胞壁的重要组成部分,参与种子萌发、营养器官发育、果实成熟、器官脱落、植物抗逆等植物生长发育过程中的多个环节。通过研究蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1启动子活性功能,为研究CpEXP1基因在蜡梅生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以蜡梅‘磬口素心’为材料,通过hi-TAIL PCR法从蜡梅基因组DNA中克隆CpEXP1基因上游调控序列,利用生物信息学软件,分析CpEXP1基因启动子序列中潜在的顺式调控元件。构建该基因与GUS报告基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法在烟草叶片中进行启动子活性的瞬时表达研究,并进一步利用花序侵染法在拟南芥中进行稳定表达,利用GUS组织化学染色和GUS报告基因的实时荧光定量PCR检测,分析CpEXP1基因启动子的活性。【结果】获得了长度为2 485 bp的蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1上游调控序列(GenBank Accession:MG452931),序列分析表明该启动子中除含有核心元件TATA-box和CAAT-box外,还包含多个与植物非生物胁迫及组织特异表达相关的顺式作用元件。在烟草中的瞬时表达分析表明该启动子具备驱动报告基因GUS表达的功能。进一步对转基因拟南芥植株的GUS组织化学染色和GUS基因表达分析结果显示,CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥种子萌发初期活性较强,在子叶以及幼苗真叶中未检测到GUS活性;在花和根中活性较弱;在成熟叶片中可以检测到GUS活性,特别是在衰老叶片叶柄脱落区表达强烈。此外,该启动子在幼果中具有较强活性,随后启动活性逐渐下降,成熟果荚中仅在果柄脱落处能够检测到GUS活性。同时,转基因拟南芥植株中的CpEXP1基因启动子活性受高温(42℃)、低温(4℃)和水杨酸(SA)诱导,特别是对低温胁迫响应强烈,在4℃低温处理后,转基因拟南芥叶片中GUS基因的表达量是处理前的的8.7倍。【结论】CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥不同发育阶段、不同器官中的活性具有明显差异,推测该启动子可能在种子发芽、叶片脱落以及果实脱落中发挥作用,同时CpEXP1基因启动子活性可被不同非生物胁迫诱导,可能参与植物抵御非生物胁迫的调控途径。 相似文献
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超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量 总被引：1，自引：0，他引：1
《林业科学》2017,(1)
【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。 相似文献
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【目的】UFO是被子植物中首个被发现的F-box蛋白,主要参与调控花分生组织特性和花器官发育。本文通过对蜡梅CpUFO基因表达特性分析及异源表达拟南芥表型分析,初步鉴定CpUFO的功能,为阐明蜡梅花发育分子调控机制提供参考。【方法】基于前期构建的蜡梅转录组数据,克隆蜡梅CpUFO基因并对其编码蛋白进行同源比对及进化树分析。根据qRT-PCR分析CpUFO基因在不同组织、器官及全年花发育各阶段中的相对表达量,比较35S::CpUFO转基因拟南芥株系及Col-0野生型表型差异,并通过qRT-PCR检测过表达拟南芥株系内源开花相关基因的表达特性,分析过表达CpUFO对拟南芥开花时间以及花器官发育的影响。【结果】获得的CpUFO基因c DNA序列为1 665 bp,编码403个氨基酸,含有保守的F-box结构域。CpUFO在外花被片中表达量相对最高,其次是内花被片,在果、茎、叶、腋芽及雌雄蕊中表达水平较低;而在全年花芽中的表达量分析结果显示,低温打破休眠后的露瓣和始花以及盛开期花芽中的表达量显著高于其他时期。与野生型拟南芥相比,35S::CpUFO转基因株系莲座叶数目减少,开花提前,且拟南芥内... 相似文献
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[目的]为研究肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因表达对竹子木质素生物合成的影响,对毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)中PeCCR基因的表达情况进行分析,并对PeCCR基因功能进行研究,以期为利用CCR基因在竹子中开展基因工程育种提供参考依据。[方法]采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法对PeCCR基因在毛竹不同组织以及不同高度笋中的表达进行了分析,采用RT-PCR方法克隆了PeCCR基因的编码区,构建了基因过量表达载体,采用蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),采用溴乙酰法测定转基因植株茎木质素的含量。[结果]qRT-PCR结果表明:在毛竹实生苗根中PeCCR的表达量最高,其次是笋中,而未展开叶中最低;在野外随着笋高度的增加,木质化程度加强,PeCCR基因的表达量呈上升趋势,在6.7 m笋中达到最高。克隆获得PeCCR编码区长度为1 026 bp,编码一个341 aa的蛋白,具有家族蛋白特有的保守结构域"NWYCYGK"。与野生型拟南芥相比,转PeCCR基因植株叶片明显增大,且抽苔时间提前3~4 d。茎横切的组织化学染色观察发现:转基因植株茎的木质部和束间纤维组织染色面积均大于野生型;木质素含量测定表明,2个过表达PeCCR1转基因株系中的木质素含量均明显高于野生型,分别为野生型对照的123.1%和116.7%。[结论]PeCCR基因在毛竹不同组织的表达存在差异,在笋中随高度增加其表达量上调。过量表达PeCCR促进了转基因拟南芥植株的生长发育,提高了木质素含量。 相似文献
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【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10~4～5.1×10~4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10~6～5.6×10~7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性; ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因; 2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。 相似文献
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外源柠檬酸对铝胁迫下马尾松生理特性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究受铝毒的马尾松幼苗施加外源柠檬酸后的一系列生长及生理特性变化,确定柠檬酸最佳缓解浓度,揭示柠檬酸缓解马尾松铝毒的生理机制,为土壤酸化地区马尾松的生长提供理论依据。【方法】以2种不同家系马尾松幼苗(耐铝型FJ5、铝敏感型GD20)为试验材料,采用水培法研究不同浓度柠檬酸对铝胁迫下马尾松幼苗株高增量、根系形态及其针叶中抗氧化酶[过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、活性氧(H_2O_2和O_2~(-·))、渗透调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸)和丙二醛含量的影响,并运用主成分分析法探讨外源柠檬酸缓解马尾松铝毒过程中起主导作用的生理指标。【结果】铝胁迫下2种家系马尾松幼苗根系总长、表面积、体积、直径及株高增量均降低,针叶内抗氧化酶活性增强,H_2O_2、O_2~(-·)、MDA和渗透调节物质含量均有所升高。经柠檬酸处理后,2种家系马尾松根系总长、表面积、体积、直径及株高增量均有所增加,其针叶内抗氧化酶活性增强,H_2O_2、O_2~(-·)、MDA和渗透调节物质含量均相应减少,且GD20变化幅度大于FJ5。主成分分析得出第一主成分中各指标贡献率大小为MDAH_2O_2脯氨酸GR。【结论】活性铝对马尾松幼苗生长产生一定的毒害作用;外源柠檬酸能有效缓解马尾松的铝毒作用,且对铝敏感型马尾松的缓解效果好于耐铝型。柠檬酸缓解铝毒的效果因浓度不同而存在差异,0.02 mmol·L-1的柠檬酸解毒效果最佳,当浓度大于0.08 mmol·L-1时,缓解效果受到抑制。MDA和H_2O_2可能是外源柠檬酸缓解铝毒作用的关键指标。 相似文献