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鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
从含有鹅细小病毒（GPV）H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEX HTb-VP3中切取GPV H1株VP3基因片段，将其亚克隆于pSY538的EcoRI位点，并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用Not I切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，亚克隆于pSY681的NotI位点，构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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本研究旨在克隆广灵大尾羊HSD17B12基因CDS，预测HSD17B12蛋白及其基因启动子区的结构和功能特性，探究HSD17B12基因在前体脂肪细胞分化过程中的表达。采用PCR法克隆HSD17B12基因CDS全长序列；生物信息学软件分析HSD17B12蛋白的理化性质、结构、功能位点和结构域，并进行亚细胞定位、序列相似性分析及其基因核心启动子区和转录因子潜在结合位点的预测；采用实时荧光定量PCR检测HSD17B12基因以及部分转录因子在前体脂肪细胞分化过程中的相对表达量。结果显示，广灵大尾羊HSD17B12基因CDS全长939bp，编码312个氨基酸；HSD17B12蛋白主要定位于内质网，有3个跨膜结构域和33个磷酸位点，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，其氨基酸序列与山羊相似性最高；HSD17B12基因有5个潜在的核心启动子区，存在SP1、ATF2和CREB1等10个转录因子的结合位点；在前体脂肪细胞分化过程中，SP1、ATF2和HSD17B12基因的mRNA表达均呈上升趋势，说明ATF2和SP1可能正向调控HSD17B12基因的表达，促进脂质沉积。本研究为进一步揭示HSD17B... 相似文献
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禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建 总被引：10，自引：1，他引：9
采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。 相似文献
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性连锁矮小鸡生长激素受体基因位点多态性分析 总被引：7，自引：0，他引：7
本研究通过构建鸡基因文库克隆了鸡生长激素受体基因，用克隆的基因片段作探针，分析正常鸡和性连锁矮小鸡在生长激素受体基因位点的多态性，证实了矮小鸡在该基因位点存在突变 相似文献
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伪狂犬病病毒鄂A株 TK－／LacZ＋突变株的构建 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI／KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI／KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点，构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK 相似文献
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本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析，获得其核心启动子区域，并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响，为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量，构建空间表达谱；通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段，构建6个双荧光素酶报告载体，通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域；对核心启动子区进行生物信息学分析，发现潜在的SP1转录因子结合位点；通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示，SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达，其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示，猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区，且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示，转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录；定点突变及EMSA试验确认，转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明，转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。 相似文献
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鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备 总被引：5，自引：0，他引：5
将克隆得到的鸡 IFN- γ基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体 p PROEXTMHT的 Pst 和 Kpn 位点上 ,构建了重组表达质粒 p PROEXTMHT- IFN -γ,经序列分析鉴定 ,确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 α,于 37℃不同时间诱导培养 ,SDS- PAGE电泳表明 ,该基因在大肠杆菌中发生高水平表达 ,表达的鸡 IFN- γ融合蛋白相对分子质量约为 2 2 0 0 0。重组蛋白占菌体总蛋白的 33%。经 Western blot鉴定 ,该重组蛋白质具有生物学活性。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IFN- γ融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射于新西兰白兔 ,制备了兔抗鸡 IFN- γ多克隆抗体。琼脂扩散结果表明 ,多克隆抗体可与纯化的鸡IFN -γ重组蛋白发生特异性反应 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(21)
为了分析ASB12基因在牛生长发育中的作用,试验以延边黄牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆ASB12基因的编码区序列及部分基因组序列,利用生物信息学方法对ASB12基因进行分析,同时采用半定量方法检测ASB12基因在不同组织的表达情况。结果表明:所克隆的牛ASB12基因编码区序列长度为1 055 bp,部分基因组序列长度为1 598 bp(Gen Bank登录号为HQ608159),包含1个内含子。生物信息学分析显示,该蛋白可能存在3个N-糖基化位点,3个豆蔻酰化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点;存在1个保守的结构域,与蛋白ANK具有较高的同源性。组织表达谱分析显示,牛ASB12基因在肌肉等多种组织中均有表达。 相似文献
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根据GenBank中牛肌肉生成抑制素（MSTN）基因序列设计了1对引物，在引物两端分别加EcoRⅠ和XhoⅠ识别位点。利用RT—PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体，酶切、PCR鉴定及测序分析表明，该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌，经IPTG诱导，牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。 相似文献
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犬α干扰素的克隆、表达及纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
根据DDBJ/GenBank基因库中已登录的犬α干扰素序列,设计了含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采取聚合酶链式反应(PCR)技术以犬基因组DNA为模板进行了CaIFN-α的成熟肽基因的克隆,扩增产物与克隆载体pGEM-T Easy Vector连接后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定和EcoRⅠ酶切鉴定,初步证实为CaIFN-α,用SphⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将目的片段与表达载体pQE30连接,然后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定、SphⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、序列测定证实已经成功克隆了CaIFN-α,构建了重组表达质粒PQE30/CaIFN-α。将重组表达菌液培养至OD600为0.5时加入IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析CaIFN-α在大肠杆菌中得到了表达,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,表达量约占细菌总量的20%左右。将诱导表达的菌液经超声裂解、变性、复性、透析后,得较纯的CaIFN-α蛋白。本研究为以后CaIFN-α的活性及临床应用研究奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达 总被引：6，自引：1，他引：5
以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物，通过RT－PCR技术，扩增其核衣壳（N）蛋白基因的cDNA；将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点；将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株，在浓度为1.0mM IPTG和37℃条件下诱导，PHN基因融合蛋白获得了表达；经SDS－PAGE，Western-blot试验，确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47kD。试验结果证明，在大肠杆菌中表达的TGEV N基因的融合蛋白产物的确具有天然蛋白的抗原性。 相似文献
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本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
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对黑腹果蝇(Drosophila m elanogaster)抗真菌肽基因Drs和它的同系物基因Drs-lC在pET-21d载体中与T7.Tag标签序列进行了融合表达,并对融合表达产物进行Xa因子切割前后的抗菌活性测定。首先通过长引物PCR获得5′端带有Xa因子识别切割序列的Drs和Drs-lC,分别克隆至pET-21d表达载体上,然后转化E.coliO rigam i(DE3),筛选得到阳性克隆。以IPTG诱导目的基因与载体上的T7.Tag标签序列融合表达,将表达产物进行初步纯化后,以Xa因子进行切割处理,然后测定处理前后样品的抗菌活性。结果显示与T7.Tag标签序列融合表达的D rs、D rs-lC样品和经Xa因子切割后的样品对供试真菌黄色镰刀菌(Fusarium culm orum)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxs-porum)和粗糙脉孢菌(Neuropora crassa)均有明显的抑制作用。 相似文献
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Iss from a virulent avian Escherichia coli 总被引：2，自引：0，他引：2
No single characteristic of virulent avian Escherichia coli has been identified that can be exploited in colibacillosis detection protocols. Research in our lab suggests a strong association between the presence of an iss DNA sequence with an isolate's disease-causing ability. The study presented here focuses on the techniques used in the expression, purification, and characterization of avian E. coli Iss protein. In brief, iss was cloned into an expression vector, the construct was transformed into a protease-deficient E. coli, and expression was induced. The protein was expressed as a glutathione-S-transferase (GST) fusion and purified by affinity chromatography. The GST portion was cleaved from Iss, Iss was harvested by affinity chromatography, and the identity of Iss was confirmed by N-terminal sequencing. Currently, purified Iss is being used to prepare hybridomas for production of monoclonal antibodies with the goal of evaluating anti-Iss as a reagent for the detection of virulent avian E. coli. 相似文献
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猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析 总被引：2，自引：2，他引：0
分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。 相似文献
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参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。 相似文献
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Zhang Zhiqiang Wu Tonglei Wu Qingmin Yan Xijun Bai Xue Zhang Yanling He Hongxuan Zhang Hongxue Liu Changhao Shi Qiumei 《畜牧与饲料科学》2018,(1)
To investigate the roles of HtrA protein in bacterial adaption to stresses, htra gene was cloned from an Escherichia coli strain isolated from silver fox, double digested, and ligated into the prokaryotic expression vector pET32a. Then, the recombinant plasmid pET32a-htra was transformed into E. coli BL21 competent cells. The over-expression of His-HtrA protein was induced by the addition of IPTG at a final concentration of 1 mmol/L, and verified by SDA-PAGE and Western blot. In addition, the protein was purified with Ni-NTA agarose, and used to immunize mice,and the polyclonal antibody specifically bound to E. coli HtrA protein. The results will provide a theoretical basis for studying the roles of HtrA protein and developing vaccines for fur-bearing animals against E. coli. 相似文献