弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定     

姜阜杉  叶建军  田静  高传亮  王宇冰  艾晴晴  魏瑶  宋淇淇 《中国兽医学报》2023,(2):329-334

为了探究刚地弓形虫SRS29C基因的生物学特性,利用大肠杆菌原核表达系统将SRS29C基因进行体外表达并制备多克隆抗体。同时利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫SRS29C基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶筛选及PCR单克隆筛选,并进行Western blot试验进一步验证SRS29C单克隆敲除株。结果显示,SRS29C蛋白在体外成功表达,且制备的多克隆抗体免疫原性良好。SRS29C基因敲除株在加入乙胺嘧啶后能够正常生长,经PCR鉴定能扩增出797 bp的5′UTR(SRS29C)片段及576 bp的3′UTR(SRS29C)片段,且未扩增出SRS29C基因片段,而在对照组中扩增出了700 bp的SRS29C片段,同时蛋白验证基因敲除株中未能表达SRS29C蛋白。结果表明,成功构建并筛选出SRS29C基因敲除单克隆虫株,暂时命名为ME49△SRS29C及RH△SRS29C,为弓形虫SRS29C基因功能的研究奠定了基础。  相似文献   

鸡外周血T淋巴细胞分群及免疫相关基因表达分析     

刘锐  李江凌  杨朝武  余春林  赵素君  王秋实  王宇萍 《中国家禽》2023,(3):17-23

为探索鸡抗病育种中简便实用的免疫功能测定指标，试验采用成像流式细胞术对四川山地乌骨鸡和大恒699肉鸡配套系的4周龄和10周龄外周血进行T淋巴细胞亚群分型，并检测外周血中白介素6(IL-6)、Toll样受体3(TLR3)和干扰素(IFN-γ)基因的表达水平。结果显示：10周龄时，CD₄⁺T淋巴细胞亚群在两鸡种间差异显著(P<0.05),4周龄和10周龄的两鸡种CD₈⁺T淋巴细胞亚群均有极显著差异(P<0.01);CD₄⁺/CD₈⁺比值在0.7～1.6之间呈正态分布，且随周龄增加而降低；大恒699肉鸡配套系的CD₄⁺/CD₈⁺比值比四川山地乌骨鸡高；IL-6和IFN-γ表达量随周龄增加而增加，但TLR3相反。细胞因子的增多和CD₄⁺/CD₈^+<...  相似文献   

刚地弓形虫PTS核酸疫苗的构建及免疫保护力评价     

《中国兽医学报》2017,(12)

旨在构建弓形虫磷脂酰苏氨酸合成酶(Toxoplasma gondii phosphatidylthreonine synthase,PTS)基因DNA疫苗,评价其抗弓形虫的免疫保护力。利用RT-PCR技术扩增得到弓形虫PTS基因,构建真核表达质粒pVAXTgPTS,然后转染HEK 293-T细胞,分析pVAX-TgPTS在细胞中的表达情况。利用真核表达质粒pVAX-TgPTS对BABL/c小鼠进行3次免疫,并用空质粒pVAX1作为对照,在每次免疫前和第3次免疫后2周收集小鼠血清,经ELISA方法检测小鼠血清中的IgG水平。第3次免疫后2周每组取3只小鼠,将其剖杀取脾脏,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD4+和CD8+T细胞百分比。小鼠脾细胞经STAg刺激后,利用ELISA试剂盒检测脾细胞细胞因子的表达情况。第3次免疫后2周,每只小鼠腹腔注射1 000个弓形虫RH株速殖子,观察记录小鼠的存活时间。结果显示,pVAX-TgPTS能够在HEK 293-T细胞中表达;第3次免疫后2周pVAX-TgPTS组血清中IgG含量相比对照组有了显著提高;pVAX-TgPTS组淋巴细胞刺激指数(SI)略微高于对照组;CD4+和CD8+T细胞百分比含量明显高于对照组;pVAX-TgPTS组中脾细胞经STAg刺激后能够明显提高IFN-γ的表达量。攻虫试验结果表明,pVAX-TgPTS组小鼠存活时间比对照组明显增长。本试验成功构建真核表达质粒pVAX-TgPTS,证明pVAX-TgPTS能够诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应,并对弓形虫感染产生一定程度的免疫保护力,该研究结果为进一步研发弓形虫核酸疫苗奠定基础。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒S、N基因核酸疫苗的构建与免疫原性试验   总被引：1，自引：0，他引：1  

杨恒  李华春  曹三杰  文心田 《中国兽医学报》2011,(11)

采用RT-PCR扩增TGEV SC-H株S基因5′端主要抗原位点编码区和全长N基因,将其插入真核表达载体pVAX1,构建单独与嵌合表达S、N基因的pVAX-S、pVAX-N、pVAX-S-N 3种重组质粒。通过脂质体将重组质粒体外转染COS-7细胞,利用间接免疫荧光检测目的基因的表达情况。将6周龄NIH小鼠随机分为5组,分别于腿部肌肉注射重组质粒pVAX、pVAX-S、pVAX-S-N、pVAX-S+pVAX-N与pVAX-S+pVAX,共免疫3次,间隔2周。通过间接ELISA以及流式细胞仪分别检测免疫小鼠血清中特异性TGEV IgG抗体和外周血T淋巴细胞亚群数量。结果显示,重组质粒构建正确且在COS-7细胞中得以表达;pVAX-S+pVAX-N质粒混合免疫组与pVAX-S+pVAX质粒混合免疫对照组相比,可有效提高免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,而pVAX-S-N免疫组与pVAX-S组比较,未能起到提高免疫小鼠血清中特异性抗体水平的和外周血T淋巴细胞亚群数量作用。以上结果表明S、N基因的联合应用可有效加强TGEV核酸疫苗的免疫效力,但这种增强作用与S、N基因联合应用的方式直接相...  相似文献   

热带无爪螨主要变应原Blo t 5和Blo t 21融合表达质粒诱导小鼠产生IgG和调节性T细胞     

罗应  彭美琪  肖正泮  罗承慧  王大勇  裴业春 《畜牧兽医学报》2022,53(4):1220-1230

旨在开发防治热带螨过敏症的兽用核酸疫苗,本试验通过对热带无爪螨主要变应原Blo t 5和Blo t 21的基因序列进行密码子优化,构建了热带螨主要变应原融合基因的真核表达载体pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG。为验证该真核表达载体的免疫效果,采用皮下注射,以100 μg/100 μL量的pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸免疫BALB/c小鼠(n=6),通过ELISA检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a的水平变化;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中调节性T细胞的变化。结果显示,真核表达质粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫小鼠后可诱导特异性IgG和IgG2a水平升高,且IgG2a/IgG1的比值升高,这暗示免疫后小鼠机体发生偏向Th1型的免疫反应。此外,该核酸疫苗可诱导小鼠产生较高水平的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T细胞,这表明该真核表达质粒免疫小鼠后可能会诱发免疫抑制。  相似文献   

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析     

闫可心  伍生军  赵云  王淼  许应天  薛书江 《中国畜牧兽医》2019,46(7):2088-2095

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。  相似文献   

口服猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌对BALB/c小鼠的免疫保护作用     

叶丽萍  郝凤奇  王春凤  杨桂连 《中国兽医学报》2010,30(7)

将轮状病毒pW425et-Vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。  相似文献   

弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究     

《中国动物传染病学报》2020,(4)

为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。  相似文献   

分子佐剂Cal对弓形虫SAG1亚单位疫苗的影响     

《中国兽医学报》2019,(5):925-930

构建分子佐剂钙网蛋白Cal与弓形虫SAG1基因的真核表达载体,探讨其对小鼠的免疫原性。采用PCR扩增Cal和SAG1基因并将其克隆至Pvax1载体中,构建出重组质粒pVAX1-Cal-SAG1和pVAX1-SAG1。将构建质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG1同空载体pVAX1通过肌肉注射的方式免疫小鼠,通过ELISA、CCK-8法和小鼠攻虫试验对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果显示:SAG1片段为855 bp,Cal-SAG1片段为1 566 bp,成功构建了真核表达质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG。小鼠免疫后pVAX1-Cal-SAG1诱导的特异性抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖反应和IL-4、IL-10、IL-12 p70及IFN-γ细胞因子水平均高于pVAX1组、pVAX1-SAG1和空白对照PBS组。攻虫后,佐剂组小鼠存活时间最长,较空白对照组多存活5 d。本研究表明:制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液和细胞免疫,分子佐剂Cal可以显著地增强弓形虫表面膜蛋白SAG1的免疫原性。  相似文献   

新孢子虫与弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒的构建及免疫应答分析     

李航  姜利建  刘晋宇  兰岚  凌芳芳  石甜甜  张贺洋  贾立军 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3336-3342

为构建新孢子虫和弓形虫AMA1基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,本试验根据新孢子虫和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框,设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因通用引物,构建重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1、pMD18T-TgAMA1及重组腺病毒穿梭质粒ADV4-Nc/TgAMA1,将ADV4-Nc/TgAMA1和骨架质粒pacAd5线性化后共转染293T细胞,包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒,测定病毒滴度后,收集病毒液接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,Nc/TgAMA1在Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒中获得表达,测定Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒滴度为10⁹PFU/mL,接种BALB/c小鼠后,Ad5-Nc/TgAMA1接种组IgG抗体水平明显高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组。结果表明,构建的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。本试验为新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒QX基因型S1蛋白重组乳酸菌的构建及小鼠免疫应答     

王栎婷  曹祁峰  王雪  李冰 《中国兽医学报》2023,(1):49-54+60

为探究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白重组乳酸菌对小鼠免疫应答情况,本研究将IBV CH/LN/2019毒株的S1基因进行密码子优化,构建重组质粒pNZ8149-S1,电转至乳酸乳球菌NZ3900中,应用Western blot及间接免疫荧光试验评价重组乳酸乳球菌表达水平,免疫SPF小鼠,通过间接ELISA方法分析小鼠特异性抗体、CD4⁺、CD8⁺和细胞因子(IL-4和IFN-γ)分泌情况;结果显示,成功构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900并表达目的蛋白;小鼠免疫试验结果显示,免疫组小鼠IgG抗体水平均高于pNZ8149/NZ3900、NZ3900和PBS组(P<0.05);特异性sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);此外,重组乳酸乳球菌能诱导小鼠产生较高水平的IL-4和IFN-γ(P<0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900可以有效刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫,为IBV新型口服疫苗的研制提供了理论参考。  相似文献   

猪白细胞介素6基因的克隆及其作为核酸免疫佐剂的研究     

杨恒  李华春  文心田  曹三杰 《中国预防兽医学报》2012,34(11)

为研究猪白细胞介素6 (pIL-6)作为核酸免疫佐剂的可行性,本研究采用RT-PCR方法,从猪外周血淋巴细胞中扩增出639 bp的pIL-6基因,编码212个氨基酸残基.将pIL-6基因克隆至真核表达载体pVAX构建重组质粒pVAX-IL6,并转染于COS-7细胞后,通过western blot检测到pIL-6在细胞中的表达.将含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的重组真核表达质粒pVAX-S与pVAX-IL6混合后腿部肌肉注射6周龄NIH小鼠,通过间接ELISA以及流式细胞仪分别检测免疫小鼠血清中特异性TGEV IgG抗体和外周血T淋巴细胞亚群数量,结果表明pVAX-S+pVAX-IL6免疫组的特异性抗体水平与外周血T淋巴细胞亚群数量显著高于pVAX-S+-pVAX对照免疫组(p＜0.05),显示了pIL-6作为核酸免疫佐剂的良好应用前景.  相似文献   

弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析     

陈慧娴  陈雅婕  王先梅  王丽芳  刘群  刘晶 《畜牧兽医学报》2022,53(7):2300-2306

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫，二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用，这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A，通过将其应用于小鼠的免疫保护试验，评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达，通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平，评价其免疫原性。二免后，分别用1×10³个弓形虫Pru速殖子、1.5×10⁷个新孢子虫Nc1速殖子攻虫，对小鼠的体重变化、存活率进行监测，并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量，评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示，rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别，相较于未免疫组小鼠，免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01)，且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P＜0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A，鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应，并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用，可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治，以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。  相似文献   

弓形虫胶体金免疫层析试纸条的研制     

《中国动物传染病学报》2017,(5)

为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,获得SAG重组表位抗原,Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用r SAG重组蛋白及r SPG分别划线,作为检测线和质控线,制作胶体金免疫层析试纸条,利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白,且该重组蛋白具有较好的免疫原性。以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条,能够快速检测弓形虫的阳性血清,为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。  相似文献   

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫     

任慧英  杨汉春郭鑫陈艳红  查振林 《中国兽医科技》2006,36(2):107-111

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒（pCI—GP5和pcDNA—U—GP5）分别肌肉注射免疫BALB／c小鼠，共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平，MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力，LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性，并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现，2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周，pCI—GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA—U—GP5质粒免疫组；而pcDNA—U—GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4%-CD8^＋T细胞比例明显高于pCI—GP5组。表明，GP5基因可诱导产生较高的免疫反应，泛素与GP5的融合表达可增强PRRSVGP5诱导的细胞免疫反应。  相似文献   

猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价     

肖莉  牛小杰  刘庆庆  王月丽  陈创夫  易继海 《中国畜牧兽医》2023,50(1):260-269

【目的】构建猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列（登录号：MH898990.1）合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于10^5.3 TCID₅₀ TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平（P<0.05）;10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于10^5.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）,而10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于10^6.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）。10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著（P>0.05）。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀。10^6.5和10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。  相似文献   

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究     

赵云  伍生军  倪婷婷  王淼  张守发  许应天  薛书江 《中国畜牧兽医》2018,45(9):2559-2565

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。  相似文献   

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

王书博  徐义刚  陈秋艳  梅朱园  崔文  姜艳平  周晗  王丽  乔薪瑗  李一经  唐丽杰 《畜牧兽医学报》2020,51(9):2238-2249

旨在构建表达猪圆环病毒2型（PCV2）cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri,L.reuteri）,并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组（P<0.01）;流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。  相似文献   

禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定     

薛菲  杨梓纯  许炎辉  王娅玲  喻婷  樊毛迪  刘娟华  高崧  刘秀梵 《畜牧兽医学报》2020,51(12):3122-3132

旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体，本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT，经IPTG诱导表达后，获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT，利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT，并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法，最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL^-1，最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合，采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体，分别命名为1G8、2C3和2G3，均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示，3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应，而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达，对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定，结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是⁸³DQDWMDS⁸⁹、⁹⁰SNPGTW⁹⁵和¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。  相似文献   

羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答     

李鹏飞  冯将  鲜思美  刘嫒  李婷  包细明  张益  张素辉 《中国兽医学报》2018,(4)

为研究所构建羊口疮病毒(OrfV)B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果,本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增,克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒,进行酶切和测序鉴定;采用脂质体法将pVAX1-B2L真核表达质粒转染MDBK细胞,RT-PCR和IFA法检测B2L基因在MDBK细胞中的转录和表达;将构建的DNA疫苗免疫KM系小鼠,采用间接ELISA、MTT和FACS法对其诱导的免疫应答进行研究。结果显示,成功构建pVAX1-B2L真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达;免疫小鼠后,DNA疫苗能诱导小鼠产生OrfV特异性抗体;脾淋巴细胞增殖、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子均高于pVAX1组和PBS组。结果表明,本研究制备的DNA疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。  相似文献