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为了探究刚地弓形虫SRS29C基因的生物学特性,利用大肠杆菌原核表达系统将SRS29C基因进行体外表达并制备多克隆抗体。同时利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫SRS29C基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶筛选及PCR单克隆筛选,并进行Western blot试验进一步验证SRS29C单克隆敲除株。结果显示,SRS29C蛋白在体外成功表达,且制备的多克隆抗体免疫原性良好。SRS29C基因敲除株在加入乙胺嘧啶后能够正常生长,经PCR鉴定能扩增出797 bp的5′UTR(SRS29C)片段及576 bp的3′UTR(SRS29C)片段,且未扩增出SRS29C基因片段,而在对照组中扩增出了700 bp的SRS29C片段,同时蛋白验证基因敲除株中未能表达SRS29C蛋白。结果表明,成功构建并筛选出SRS29C基因敲除单克隆虫株,暂时命名为ME49△SRS29C及RH△SRS29C,为弓形虫SRS29C基因功能的研究奠定了基础。 相似文献
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为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen, SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果，试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定，同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染，再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况；用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠，用ELISA法测定血清IgG水平，CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力，流式细胞仪测定CD4+和CD8+T淋巴细胞百分比，ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况；进行小鼠体内攻虫试验，记录小鼠存活时间。结果表明：成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku; pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4+ 相似文献
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