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本研究建立了检测鸭疫里默氏杆菌（Rimerrlla anatipestifer,RA）抗体的全菌体抗原间接ELISA方法,最佳血清稀释倍数为1：100。以RA1的甲醛灭活全菌体为包被抗原,棋盘滴定法试验确定其最适抗原包被浓度为5×10^8CFU／mL。与全菌体裂解抗原和重组P25蛋白为包被抗原的间接ELISA方法相比较,三者均可检测不同血清型RA标准阳性血清,结果符合性良好。用该方法检测雏鸭接种鸭疫里默氏杆菌蜂胶灭活疫苗后血清抗体水平的变化,发现免疫后10天抗体水平开始上升,二免后10天抗体水平达到峰值。 相似文献
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为研究血清1型鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer,RA)的灭活油乳剂疫苗,本研究将10株血清1型RA的临床分离株经腿部肌肉注射7日龄雏鸭进行动物体内复壮,结果表明所有被测菌株均具有较强的毒力,易感雏鸭致死率100％.对其中3株RA分离株CH3、WJ4和YL4的毒力测定结果表明其半数致死量(LD50)分别为2×108 cfu、3.25×108 cfu和2.37×106 cfu.选取5株RA分离株分别制备灭活油乳剂疫苗,分别于5日龄和18日龄对樱桃谷鸭进行两次免疫后,免疫鸭能够产生高水平的RA特异性抗体,对2 LD50 WJ4或CH3攻毒产生很好的保护效果,其中由CH3、CQ3和YXb12制备的灭活油乳剂疫苗对攻毒的保护率高达100％. 相似文献
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以1型鸭疫里氏杆菌(RA)全基因组保守区域ompA基因的重组表达产物为包被抗原,建立了检测RA血清抗体的间接ELISA方法。原核表达的重组ompA蛋白经纯化后作为包被物,以方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度为1.5μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100。与普通的微量凝集试验相比较,该方法灵敏度高于凝集试验约16倍～128倍。与鸭源大肠埃希菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭链球菌、鸭源呼肠病毒、鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒感染鸭血清均无交叉反应,表明该方法特异性好。利用该方法检测了雏鸭免疫RA灭活油乳剂疫苗之后血清抗体水平。 相似文献
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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染是主要危害2~8周龄雏鸭的高致病性细菌性传染病。为研制血清10型RA灭活油乳剂疫苗,选取10株血清10型RA分离株进行动物体复壮、分离和鉴定后,分别对部分毒株进行了毒力测定和灭活油乳剂疫苗的研制。结果表明,所有试验用分离株对7日龄雏鸭均具有较强的致病力。分离株YXL1和HXb2的半数致死量分别为2.8×108 cfu和82 cfu,不同菌株之间的毒力差异很大。用研制的灭活油乳剂疫苗对雏鸭进行2次免疫后,免疫鸭可获得高水平的特异性抗体,并可抵抗强毒RA的攻击,以HXb2免疫后的攻毒保护性最好。抗体水平检测和攻毒保护试验结果表明,用血清10型RA分离株HXb2制备的油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护作用。 相似文献
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选取6株(300、303、316、325、327和343)猪源大肠杆菌免疫家兔制备高免血清,与6株菌的全菌抗原、菌体(O)抗原、渗透因子及外膜蛋白抗原分别进行交叉凝集试验和琼脂扩散试验。结果表明,大肠杆菌的主要抗原为O抗原,其中300和303 2株菌的抗体与其他4株菌的抗原具有广泛的交叉性。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(5)
为研制血清2型和11型鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)二价灭活疫苗,以RA1325株(2型)和RA1229株(11型)为菌种,经培养、灭活、浓缩,混合后制成二价灭活油乳剂疫苗。将疫苗皮下接种7日龄番鸭,免疫后7、14、21、56、63、70、77 d进行攻菌试验,测定疫苗的免疫原性。免疫后每隔7 d用ELISA方法测定血清中的抗体。结果表明,疫苗免疫后14 d产生良好保护,保护率超过80%,免疫持续期可达60 d。免疫后14~63 d抗体效价处于较高水平,说明研制的二价灭活疫苗能对血清2型和11型RA引起的鸭疫里默氏菌病产生良好的预防效果。 相似文献
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为探索鸭疫里默杆菌不同血清型菌株的共同保护性抗原,克隆表达mazp基因,并采用动物试验测定表达蛋白的免疫原性。根据RA-GD株mazp基因核苷酸序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆测序获得RA-AF株细菌1 326bp的核苷酸片段,比较分析发现其保守性高。以克隆的mazp基因构建重组表达质粒pET-32a-mazp并转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导获得重组蛋白。重组蛋白为免疫抗原免疫小鸭15d后,RA-BSY(血清1型)和RA-AF(血清2型)攻毒的保护指数分别为77.8和62.4;抗血清能延迟发病和死亡时间。结果表明,鸭疫里默杆菌mazp蛋白具有免疫原性,免疫鸭对血清1型和2型RA感染具有抵抗力。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(12):2322-2329
旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)中的crp基因,并探究该基因与菌株毒力的关系,了解crp基因突变株的免疫保护效力,为开发新型R.anatipestifer减毒活疫苗奠定基础。采用P-BLAST在R.anatipestifer蛋白质组中搜寻与沙门菌crp基因相似的蛋白基因,发现R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因与沙门菌crp基因相似度为45%;将B739-0373基因克隆到表达载体上,并回补到沙门菌Δcrp突变株中,利用麦芽糖-麦康凯培养基颜色反应对其糖代谢功能进行鉴定,结果发现该基因可完全回补沙门菌自身crp的缺失,推测R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因具有类似沙门菌crp基因的功能;利用同源重组和自杀质粒,构建R.anatipestifer CH-1Δcrp突变株,比较野生及突变株的生长情况和毒力(包括黏附率、侵染率、LD_(50)、在雏鸭肝脑中的定殖能力),结果表明,crp基因的缺失使菌株生长变得缓慢,黏附力(P0.01)和侵染力(P0.001)显著下降,对雏鸭的半数致死量(LD_(50))显著提高,在雏鸭肝脏、脑中定殖能力也显著下降(P0.01);在CH-1Δcrp突变株免疫雏鸭后7,14,21 d,检测雏鸭血清中IgG水平,并以R.anatipestifer野生株对免疫后的雏鸭进行肌注攻毒,观察其临床症状和免疫保护率,发现Δcrp突变株能刺激雏鸭产生高水平的IgG抗体(P0.01),对雏鸭的免疫保护率为100%。综上表明, B739-0373基因鉴定为R.anatipestifer CH-1株的类似crp基因,可全局调控该菌株的生长和毒力;安全剂量的CH-1Δcrp突变株可诱导雏鸭产生较强的免疫保护效力,可作为新型减毒活疫苗的候选菌株。 相似文献
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血清2型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)分离株经雏鸭体内复壮、回收、鉴定后,选取其中2株细菌NJ3和Yb2进行毒力测定,结果表明其半数致死量分别为5.62×107CFU和1.07×105CFU。选取5株细菌制备灭活油乳剂疫苗后免疫鸭,并进行攻毒保护试验。结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性ELISA抗体和攻毒保护力,但是攻毒保护性差异较大,NJ3免疫后的攻毒保护性最好。抗体检测及攻毒保护实验表明NJ-3是较理想的制苗用菌株。 相似文献
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鸭疫里默氏杆菌OmpA/motb蛋白的表达纯化及免疫学特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究对血清1型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)CH3株的ompA/motb基因核苷酸序列及其蛋白进行生物学信息分析,用PCR技术扩增获得去除信号肽编码区段的ompA/motb基因,并构建重组表达质粒pET30a-OmpA/mtob,成功表达分子量约为55 kDa的重组蛋白rOmpA/motb。Western blot结果显示,rOmpA/motb能与血清1、2、10和15型RA阳性血清发生特异性反应,表明rOmpA/motb具有交叉免疫原性。以纯化的rOmpA/motb免疫新西兰大白兔,经3次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗体效价为1:256 000;Western blot结果显示OmpA/motb兔多抗可与血清1型、2型、10型和15型RA菌株发生特异性结合反应,与其他菌株无反应性。本研究制备的RA OmpA/motb多克隆抗体具有良好的反应性及特异性,为进一步研究OmpA/motb蛋白的免疫学功能及建立鸭疫里默氏杆菌病的诊断方法奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(3)
为探究鸭疫里默氏杆菌CH3株TonB1和TonB2蛋白对其生物被膜形成的影响,本研究采用自杀质粒同源重组的方法分别构建了tonB1和tonB2基因的缺失突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2。同时将tonB1和tonB2基因ORF克隆于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭表达载体pRES中,构建回补株CH3△tonB1(pRES-TonB1)和CH3△tonB2(pRES-TonB2)。利用结晶紫染色法对野生株CH3、突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2及其回补株的生物被膜进行测定。结果表明,与野生株CH3相比,突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2生物被膜形成能力显著降低(p0.05),而回补株CH3△tonB1(pRES-TonB1)和CH3△tonB2(pRES-TonB2)的生物被膜形成能力较突变株显著增强。本研究结果表明鸭疫里默氏杆菌的TonB1和TonB2蛋白与其生物被膜的形成相关。 相似文献
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【目的】制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州流行株蜂胶灭活疫苗。【方法】选取RA血清2型贵州流行株(RA-SS-8株)为基础菌株,依次利用分光光度法和平板计数法测定细菌生长曲线,再进行灭活条件筛选,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验、安全性检验及免疫鸭攻毒保护性试验。【结果】分光光度法测定RA-SS-8株菌液D600 nm值随培养时间变化显示,细菌在0~3 h时增殖缓慢,在3~10 h时增殖趋势明显加快,在10 h以后增殖逐渐趋于平缓,随着培养时间的延长,细菌最终进入衰亡期;平板计数法结果显示,RA-SS-8株D600 nm值为0.1~0.8时,该菌处于对数生长期,且D600 nm值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37 ℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×109 CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/mL;无菌检验巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变;免疫鸭攻毒保护性试验显示,蜂胶灭活疫苗免疫组鸭对RA-SS-8株的攻击后保护率为70%,蜂胶灭活疫苗对试验鸭心脏、肝脏组织均具有良好的保护效果。【结论】本研究成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,为蜂胶灭活疫苗制备和动物免疫试验奠定基础。 相似文献
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【目的】根据鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)血清1型、2型贵州流行株制备二价灭活疫苗,为鸭疫里氏杆菌病的防控及疫苗研制提供研究资料。【方法】以血清1型RA(RA-G06株)、血清2型RA(RA-HS01株)地方流行株为菌种,通过涂板法测定菌株生长曲线,利用改良寇氏法计算菌株对鸭的半数致死量(median lethal dose, LD50),将2株菌培养至终浓度为1×1010 CFU/mL后等比例混合,以卡波姆为佐剂制备二价灭活疫苗,经疫苗质量检验后进行雏鸭免疫试验;通过检测免疫鸭血清中特异性抗体水平和攻毒保护试验评价疫苗的保护率,对攻毒试验鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织进行组织病理学观察。【结果】RA-G06株和RA-HS01株均在培养12 h时到达峰值,活菌数分别为2.1×1011和3.3×1011 CFU/mL,LD50分别为1.44×1010和2.63×108 CFU/mL;制备的疫苗安全性良... 相似文献
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鸭疫里氏杆菌液体发酵培养工艺研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在利用液体发酵装置对鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)GN52株在改良酵母肉汤中的发酵培养情况进行研究。通过染色镜检、活菌计数、D450 nm值测定、pH测定等方法对RA的生长规律进行摸索,确定培养方法、最佳收菌时间及最佳灭活条件。结果表明,RA在培养过程中,菌液pH基本不变;37 ℃液体发酵培养20 h活菌含量最高,可达320亿~350亿CFU/mL;0.3%甲醛37 ℃灭活18 h为最佳;D450 nm值与活菌数之间存在一定的函数关系,可通过测定RA菌液的D450 nm值推算其活菌数。 相似文献
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以鸭疫里默氏杆菌血清1型（RA1）基因组文库中筛选获得的一种“保守假定蛋白P25”基因的重组表达产物为包被抗原，建立了检测RA血清抗体的间接ELISA。诱导表达的重组P25蛋白纯化后进行包被，十字交叉滴定试验确定，此ELISA的最适抗原包被浓度为0．6μg／mL，血清最佳稀释度为1：64，与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌感染鸭血清无交叉反应。以RA1的P25为包被抗原对RA2、5、8、10血清型的标准分型血清和经临床剖检诊断的病鸭血清进行检测，其结果均为阳性。以RA1型的P25基因设计的特异性引物分别扩增出了RA2、5、8、10的P25基因。所扩增的P25基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列和抗原表位在这些不同血清型间高度保守，提示此P25蛋白是各种血清型RA间的共同抗原，所建立的ELISA可以用于检测不同血清型RA的感染。 相似文献
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本试验为建立鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法,以RA贵州分离株RAG06基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌OmpA基因,构建pET32a-OmpA重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,重组菌经诱导、超声、纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定获得OmpA重组蛋白大小约57 KD;以OmpA重组蛋白为包被抗原初步建立ELISA方法并优化,经多次方阵检测结果显示,OmpA蛋白以2.243 mg/mL的浓度进行包被,血清以1:100稀释,抗原包被条件为4℃过夜、封闭条件为37℃ 120min、血清反应时间为37℃60min、酶标抗体工作浓度为1:1000、酶标抗体反应时间为37℃ 60min、显色时间为15min为最佳条件。确定临界值为0.389。特异性试验表明RA阳性血清有较好反应外,其他血清均无明显反应。批内变异系数2.77%-8.00%,批间变异系数为1.10%-7.80%。当阳性血清稀释比例为1:1600时,仍可判断为阳性,敏感性较高。应用该方法检测贵州省120份鸭血清、65份鹅血清证明该方法能用于水禽源鸭疫里默氏杆菌的检测,应用该方法检测灭活疫苗免疫后的鸭血清和卵黄抗体,结果表明符合灭活疫苗消长规律。本试验建立的ELISA方法,为RA的流行病学调查和RA抗体监测提供了血清学诊断方法。 相似文献
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鸭疫里氏杆菌不同血清型广西株的分离鉴定 总被引：9，自引：0，他引：9
从广西部分地区9个发病鸭场的病料中分离出9株疑似鸭疫里氏杆菌，经培养特性、形态、染色性及生化反应特性等鉴定为鸭疫里氏杆菌（RA）。RA血清型分型试验结果表明，9株分离菌中有7株（GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX8）属血清型Ⅰ型；另2株（GX7、GX9）与GX1株的阳性血清无交叉凝集反应，GX7、GX9株制备的阳性血清也无交叉凝集反应，表明这2株菌既非Ⅰ型又不属同型的RA。经致病性试验，GX1株具很强的致病力，能使北京鸭和本地麻鸭发病死亡，GX7和GX9株仅能使北京鸭发病死亡，而不致本地麻鸭发病。结果表明，广西存在着不同血清型的RA，而且有的菌株致病性很强。 相似文献