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从猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库中筛选、克隆的Ts01基因，设计表达性引物，亚克隆到pGEX-4T-1表达载体，构建了pGEX-GST-Ts01的融合表达重组载体，转化BL21寄主菌和IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE和Western蛋白分析．表明成功地高效表达了约40000右的融合蛋白质．与预测的相对分子质量大小一致，表达量达40％左右。表达产物具有免疫学活性，而且呈可溶性，未形成包涵体，这与用蛋白质软件分析的Ts01编码蛋白水溶性相一致。 相似文献
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本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础.将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定.同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测.结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性.同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性.EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础. 相似文献
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本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆 总被引：1，自引：2，他引：1
研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。 相似文献
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猪带绦虫六钩抗原基因的克隆与表达 总被引：13，自引：3，他引：10
以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０＾４和６×１０＾４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合约占工程菌总蛋白２３％。 相似文献
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为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku． 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体，利用RT-PCR方法从TGEV TH98株中扩增出M蛋白基因，并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明，从TGETH-98株克隆到了M基因cDNA，该基因全长789bp，与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92．37％、98．35％、99．87％和96．96％。SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒获得了约57ku的目的带，其中M蛋白的分子质量约为31ku，与预期的结果一致；Western-blotting分析表明，融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实，TGEV的M基因高度保守，构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。 相似文献
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猪带绦虫10 ku蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
将猪带绦虫六钩蚴10ku蛋白（TS010）和囊尾蚴10ku蛋白（CE10）的基因克隆到表达载体中,构建重组表达载体pGEX-4T—TS010和pGEX-4T—CE10,经测序证明基因序列完全正确。重组表达载体转化大肠杆菌后诱导表达,用SDS-PAGE、Western—blot和薄层扫描检测表达产物。表达的目的蛋白纯化后用于血清样品ELISA检测。SDS-PAGE、Western—blot和薄层扫描检测结果表明,六钩蚴和囊尾蚴10ku蛋白基因均能在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白的相对分子质量约为35ku,并能被囊虫病人阳性血清所识别,具有反应原性,表达量分别占菌体蛋白总量的25％和30％。ELISA检测结果显示,10ku蛋白可用于囊虫病的诊断。 相似文献
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将含有抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因（ScFv）和绿脓杆菌外毒素基因（PE40）的重组质粒pET28．ScFv-PE40转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,表达产物通过SDS-PAGE和westernblot鉴定,其表达蛋白的相对分子量约为68ku,表达量约占菌体总蛋白的13．8％。将融合蛋白通过金属Ni2^＋亲和层析柱纯化后,目的蛋白纯度在95％以上,可溶性蛋白的回收率约为50％,回收量为5mg／L。本研究所进行的纯化重组蛋白的体外杀伤六钧蚴试验表明,重组蛋白对六钩蚴具有较强的杀灭作用,而且与其剂量呈正相关性。 相似文献
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青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析 总被引：7，自引：0，他引：7
从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA，用EG95特异性引物进行PCR扩增，并克隆至pGEM-T Easy载体上，经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后，用DNAstar软件对3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明，EG95基因的3个序列(EG95-QH-1、EG95-QH-2和EG95-QH-3)的片段大小为1435～1437 bp。与GenBank中的EG95基因同源性为73．2％～99．2％，差异集中在内含子区域。其中EG95-QH-1、EC-95-QH-3与GenBank EG95XJ-ag、EG95-4序列的同源性较高；EG95-QH-2与GenBank中EG95-1、EG95-2、EG95-3序列的同源性较高。研究结果表明，青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的3个序列为EG95基因家族的成员。 相似文献
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根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。 相似文献
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定点突变猪带绦虫六钩蚴（oncosphere）Tsol18基因的4个碱基,并截去其N端16氨基酸信号肽的编码序列,构建pGEX-Tsol18-sp表达载体,IPTG诱导表达后进行产物的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析;取该基因修饰前、后所表达的重组蛋白免疫猪,以ELISA检测抗体水平,并通过屠宰检虫评价、比较免疫效果。结果显示：修饰后的Tsol18-sp基因共有7个碱基发生同义突变,表达产物主要是约38.7 ku的可溶性融合蛋白,在4℃保存2个月后约降解20.1%,能与猪带绦虫六钩蚴阳性血清反应;TSOL18和TSOL18-sp抗原免疫试验猪后均能诱导高水平抗体的产生,但TSOL18-sp抗原的保护率较TSOL18抗原有明显的提高（100%vs 20%）。表明Tsol18经修饰后,其重组表达产物的生物学活性和稳定性都有很大改善,可作为囊虫病免疫预防的候选抗原。 相似文献
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本研究采用RT-PCR技术扩增猪带绦虫六钩蚴TSOL16免疫原基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建TSOL16基因的pGEX-4T-1原核表达载体,用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western blot分析;将所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体验证其免疫原性。结果显示:所克隆的TSOL16基因片段长度为559bp,含有1个402bp的开放阅读框架,编码134个氨基酸,与已报道的猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因核苷酸序列同源性为99%;表达的融合蛋白大小为40Ku,并能被猪带绦虫六钩蚴阳性血清所识别;免疫小鼠在1周后即检测到血清抗体,第30d即达到较高水平,说明该融合蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献
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根据已克隆的堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物，用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架(ORF)后克隆至表达载体pET-32a( )，构建了重组表达质粒pET-32a( )-cSZ1，并将其转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达，表达产物量可达菌体总蛋白的9．3％，融合蛋白的分子质量约为40ku。重组菌诱导表达的产物经SDS—PAGE后，用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析，结果为阴性，提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位。 相似文献
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通过免疫筛选法，从构建的犬吉布森巴贝虫cDNA基因表达文库中筛选到1个cDNA克隆，此cDNA核苷酸全长2108bp，包含1个完整的开放阅读框，编码蛋白的分子质量约为62ku。经过分析，此蛋白（BgAMA-1）与其他巴贝虫属的顶膜抗原-1具有较高的同源性。为了研究其生物学活性，以此cDNA为模板，利用PCR扩增BgAMA-1的全基因，并将其克隆到pGEX-4T-3载体上，构建了原核表达载体pGEX-4T-3／BgAMA-1。通过Western—blotting对表达并纯化的重组蛋白的生物学活性进行分析。结果显示，构建的pGEX-4T-3／BgAMA-1能在大肠杆菌DH5口中表达，所获的重组抗原BgAMA-1在Western—blotting上仅与吉布森巴贝虫感染犬血清发生反应，证实其具有种特异性，在诊断方面可能有一定的应用价值。 相似文献
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以多头带绦虫Tm7重组蛋白为抗原,建立动物多头蚴病早期诊断方法.本研究从羊脑多头蚴原头节提取总RNA,采用RT-PCR技术首次扩增出Tm7基因的全序列,该基因的开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸.将此基因克隆到pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a-Tm7,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以纯化后的表达蛋白作为抗原,建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白间接ELISA方法.研究结果表明,Tm7基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物为约27 ku的融合表达蛋白,该蛋白能识别羊脑多头蚴病阳性血清.建立的间接ELISA方法,检测敏感性可达93.3％,特异性达94.1％,研究结果表明Tm7重组蛋白可作为脑多头蚴病的诊断抗原. 相似文献
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赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达 总被引：10，自引：3，他引：7
为获得赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)的核蛋白重组抗原，根据其基因序列(S mRNA)设计合成了1对特异性引物，对AKAV N基因进行RT-PCR扩增，产物大小约为696bp，回收纯化后，将其克隆至pMDl8-T质粒栽体中，经核苷酸序列分析，与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的S mRNA基因比较后发现，所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达98．3％，推测的氨基酸同源性为97．6％，证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD／Thio TOPO表达栽体，转化TOPl0细胞，成功地构建了AKAV N基因重组表达栽体。经L-araboinose诱导表达，可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约42．5ku，其表达产量约占茵体总蛋白的28％，融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原，可作为ELISA包被抗原。 相似文献
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本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌（ＥＳ）抗原，应用酶联兔疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）首次对六钩蚴ＥＳ抗原的反庆原性进行了初步分析。以５μｇ／ｍｌ包被反应板分别与已知阳性，阴性血清；人工感染血清；免疫血清；疫区屠宰绵羊血清；肝片吸虫，细颈囊尾蚴以及边虫感染的绵羊添反应，结果表明六钩蚴ＥＳ抗原具有较好的反庆原性。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析以抗原有一定的纯化作用。纯化六钩蚴ＥＳ抗原可 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献