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1.
犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析 总被引：8，自引：3，他引：8
根据GenBank中A75／14株犬瘟热病毒（CDV）核衣壳蛋白（N）基因的核苷酸序列设计合成一对引物，经RT-PCRgA病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因，将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达栽体pPROEXX^TM HT，用重组质粒pPROEX^TM HT-N转化感受态E．coli DH5a细胞，用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白，占菌体总蛋白18％。经Western blot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性，将表达产物用ProBond^TM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应，经琼扩试验测定其效价为1：16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原，建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。 相似文献
2.
对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
3.
参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献
4.
为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。 相似文献
5.
鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
6.
猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。 相似文献
7.
鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。 相似文献
8.
犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onolerstepoort株核蛋白基因(N)序列，设计了1对特异性引物，用该引物对分离的TN野毒株进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T质粒连接，得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定，CDVTN株N基因的ORF全长1569bp，编码523个氨基酸；将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较，N基因核苷酸序列的同源性为94％～99％，推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97％～99％。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位)。中间的区域则高度保守。此外，在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y-P-A-L-G-L-H-E-F9肽序列，推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现，推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高，提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。 相似文献
9.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
10.
为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku． 相似文献
11.
猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
应用RT—PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白基因(N基因)，并将其克隆到pET-32a载体，构建了高效原核表达载体pETN。将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明，插入片段序列与PRRSV美洲型ATCC VR2332株的ORF7核苷酸序列同源性达99．9％，与分离毒株的同源性达99．0％。 相似文献
12.
鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
13.
利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts882蛋白基因,测序结果表明：序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99％;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Westernblot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts882的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。 相似文献
14.
猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达 总被引：3，自引：1，他引：3
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。 相似文献
15.
根据巴氏杆菌磺胺耐药基因Sul Ⅱ序列设计引物，以临床分离的禽源巴氏杆菌磺胺耐药菌株为模板，扩增出禽源巴氏杆菌Sul Ⅱ的全长基因序列。经T载体克隆和核苷酸序列测定，克隆的Sul Ⅱ基因与文献报道的同源性为98．9%，有9个碱基的差异，但所编码的氨基酸没有改变。将Sul Ⅱ基因按正向的阅读框架与表达戴体pET-28c( )连接，重组质粒经酶切鉴定正确后，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测，融合蛋白的表达产物占菌体总蛋白的11％，蛋白表达形式为包涵体表达。 相似文献
16.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
17.
猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：4，他引：1
参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。 相似文献
18.
参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5（MSP5）基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因.将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析.结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp.将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体.将其转化到DH5a宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku.Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别. 相似文献
19.
提取巨型艾美球虫(Eimeria maxima)南通株(NT株)配子体总RNA,应用RT-PCR技术对gam82基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析.结果表明,克隆的基因全长为1 791个核苷酸,具有一个完整的开放阅读框,编码596个氨基酸,与GenBank中发表的Houghton株gam82基因同源性为100%.根据对推导的氨基酸序列的二级结构和抗原表位分析的结果,筛选免疫原性良好的区域,命名为gam82-Y,进行原核表达.重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,gam82-Y基因片段在大肠杆菌中得到了融合表达,相对分子质量约为53 000.可溶性分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在.以 E.maxima高免血清为一抗进行Western-blot检测,显示重组抗原gam82-Y具有免疫原性. 相似文献
20.
用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。 相似文献