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1.
试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。 相似文献
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为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。 相似文献
3.
依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。 相似文献
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单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。 相似文献
5.
为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。 相似文献
6.
猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。 相似文献
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为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku. 相似文献
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为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。 相似文献
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LI Bao-bao NIE Xin YANG Xiao-jian CAO Rui-yong ZHU Shu HUANG Hai-feng ZHANG Zhen-xing PENG Dong-mei LI Guo-hua LI Ya-ying WANG Feng-yang DU Li 《中国畜牧兽医》2017,44(7):1947-1953
This study was aimed to clone and express dhbC gene of Brucella melitensis, and analyze the bioinformatics of its expressed protein. A pair of primers were designed by referring to dhbC gene sequence information of Brucella melitensis M5-90 strain in GenBank, and the dhbC gene fragment was amplified by PCR method. The obtained dhbC gene was ligated into pMD20-T vector to construct pMD20-T-dhbC recombinant plasmid and transformed into E.coli DH5α competent cells. The plasmid was identified by restriction enzyme digestion. The recombinant plasmid pET28a-dhbC was constructed and transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The expression was induced by IPTG. The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. Bioinformatics analysis of the amino acid sequence encoded by dhbC gene was carried out using bioinformatics software DNAMAN and related online sites ProtParam, SOPMA and Protscale. The results showed that dhbC gene was cloned with the length of 1 093 bp, and protein expression was expressed. The expressed fusion protein was about 47 ku, and was mainly in the form of inclusion body. The molecular weight of the dhbC protein was C1866H2968N544O562S15, the molecular mass was 42 496.3 u, the theoretical isoelectric point (pI) was 5.81, the extinction coefficient was 33 835, the instability coefficient was 36.76, the hydrophobic index was 86.19, the total average hydrophobicity (GRAVY) was -0.215. The half-life of reticulocytes in mammals was predicted to be 30 h, and the secondary structure was dominated by α-helix (41.94%) and random coil (31.46%). 相似文献
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试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。 相似文献
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类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析 总被引：2，自引：2，他引：0
试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因进行克隆与原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因序列，设计1对引物。通过PCR扩增得到大小为1 641 bp的groEL基因片段，将其连接至pMD19-T载体，构建pMD19-T-groEL重组质粒，经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定正确后，构建重组质粒pET-28a（+）-groEL。将鉴定正确的pET-28a（+）-groEL质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导表达，运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定，利用DNAMAN和BioEdit等软件进行生物信息学分析。结果发现，试验成功克隆了类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因并进行了蛋白表达，表达的融合蛋白大小约为64 ku，GroEL蛋白的分子式为C4510H7381N1641O1840S521，原子总个数为15 893，消光系数为32 500，不稳定指数为40.31，亲水性平均值为0.901。GroEL蛋白二级结构中α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、无规则卷曲（Cc）分别占48.71%、13.19%和38.10%。本试验结果为深入探究类鼻疽杆菌groEL基因的分子作用机理奠定了基础。 相似文献
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伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。 相似文献
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鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析 总被引：2，自引：1，他引：1
根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。 相似文献
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核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
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为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ（Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ）轻链四聚体前体链β2微球蛋白（β2-microglobulin,β2m）的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β2m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β2m基因,将扩增的绵羊β2m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β2m,经双酶切后与表达载体pET-28a（+）连接,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中构建pET-28a（+）-OLAⅠ-β2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2m蛋白的二级结构。PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β2m,插入的目的片段大小为357 bp。阳性克隆菌株与表达载体pET-28a（+）经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后获得pET-28a（+）-OLAⅠ-β2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β2m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β2m蛋白的二级结构元件α-螺旋（Hh）、β-折叠（Ee）和无规则卷曲（Cc）分别占22.03%、22.03%和55.93%。本研究成功构建了小尾寒羊β2m基因的pET-28a（+）重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β2m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础。 相似文献
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参照GenBank中已发表的ApxⅣ基因序列,以自行分离的App DNA为模板,利用PCR方法扩增出ApxⅣ3′端,大小为552bp的保守基因序列。将PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector中,获得重组质粒pMD-ApxⅣ,对其重组质粒pMD—ApxⅣ进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切,并将酶切产物克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,构建了重组表达质粒pET—ApxⅣ。将表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明pET—ApxⅣ在BL21中成功表达,并能被App阳性血清所识别,具有良好的免疫原性。表达蛋白的分子质量约为39．5KOa。利用HiTrap FF crude columns将表达的蛋白进行了纯化。 相似文献
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将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。 相似文献
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根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性. 相似文献