成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备     

喻华英  高丰  王景林 《中国兽医学报》2005,25(6):604-607

根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列，设计合成了2对引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM—TA2。用BamHⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ双晦切pGEM-TA1和pGEM—TA2．均得到大小为895bp的ShT-A基因片段，分别与pQE30和pET21a（＋）原核重组表达载体连接．构建pQE30-A2和pET-21A，原核重组表达质粒。工程菌M15／pQE30-A2和BL-21／pET-21A1经lPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E．coli细胞产生毒性作用。DNAsis软件分析ShT-A基因序列，发现在513bp处有HindⅡ位点．以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅡ从pGEM-TA。切出1个513bp的截短片段．重新插入表达载体pQE30．经PCR和双酶切鉴定正确后，得到pQE30-A513重组表达质粒．转化E．coli M15经IPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，在20000处出现1条特异性的表达蛋白带．与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析，试截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37．4％，主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明．表达的重组ShT—A513，蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。  相似文献   

北京鸭抑制素α-亚基免疫原的制备及活性研究     

田锦 《中国畜牧兽医》2012,39(7):134-137

将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。  相似文献   

类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析   总被引：2，自引：2，他引：0  

黄海峰  张振兴  杨小健  曹瑞勇  李宝宝  聂鑫  朱姝  李国华  彭冬梅  李亚颖  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2018,45(2):302-309

试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因进行克隆与原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因序列，设计1对引物。通过PCR扩增得到大小为1 641 bp的groEL基因片段，将其连接至pMD19-T载体，构建pMD19-T-groEL重组质粒，经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定正确后，构建重组质粒pET-28a（+）-groEL。将鉴定正确的pET-28a（+）-groEL质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导表达，运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定，利用DNAMAN和BioEdit等软件进行生物信息学分析。结果发现，试验成功克隆了类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因并进行了蛋白表达，表达的融合蛋白大小约为64 ku，GroEL蛋白的分子式为C₄₅₁₀H₇₃₈₁N₁₆₄₁O₁₈₄₀S₅₂₁，原子总个数为15 893，消光系数为32 500，不稳定指数为40.31，亲水性平均值为0.901。GroEL蛋白二级结构中α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、无规则卷曲（Cc）分别占48.71%、13.19%和38.10%。本试验结果为深入探究类鼻疽杆菌groEL基因的分子作用机理奠定了基础。  相似文献   

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达     

贾晓晓  焦寒伟  郭莳雨  史巧芸  荣辉  张珈宁  朱华培  杜丽  成鹰  王凤阳 《中国畜牧兽医》2013,40(9):51-54

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。  相似文献   

布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析     

赵天靖  贾晓晓  焦寒伟  朱华培  徐开莲  郭莳雨  史巧芸  荣辉  成鹰  张珈宁  庞峰  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2014,41(9):11-14

本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。  相似文献   

羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析     

李宝宝  聂鑫  杨小健  曹瑞勇  朱姝  黄海峰  张振兴  彭冬梅  李国华  李亚颖  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2017,44(7):1947-1953

试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C₁₈₆₆H₂₉₆₈N₅₄₄O₅₆₂S₁₅,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。  相似文献   

类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析     

黄海峰  张振兴  杨小健  曹瑞勇  李宝宝  聂鑫  朱姝  李国华  彭冬梅  李亚颖  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2018,(2)

试验旨在对类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因进行克隆与原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板,参考GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因序列,设计1对引物。通过PCR扩增得到大小为1 641bp的groEL基因片段,将其连接至pMD19-T载体,构建pMD19-T-groEL重组质粒,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定正确后,构建重组质粒pET-28a(+)-groEL。将鉴定正确的pET-28a(+)-groEL质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定,利用DNAMAN和BioEdit等软件进行生物信息学分析。结果发现,试验成功克隆了类鼻疽伯克霍尔德菌groEL基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为64 ku,GroEL蛋白的分子式为C4510H7381N1641O1840S521,原子总个数为15 893,消光系数为32 500,不稳定指数为40.31,亲水性平均值为0.901。GroEL蛋白二级结构中α-螺旋(Hh)、延伸链(Ee)、无规则卷曲(Cc)分别占48.71%、13.19%和38.10%。本试验结果为深入探究类鼻疽杆菌groEL基因的分子作用机理奠定了基础。  相似文献   

猪SLA—DRB基因的克隆及在大肠杆菌的表达     

吴雪斌  李学伟 《甘肃畜牧兽医》2008,38(5)

试验旨在通过基因工程方法获得重组猪SLA-DRB蛋白。根据基因库猪SLA-DRB基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及保护碱基;提取长白猪肠系淋巴结RNA,用RT-PCR的方法扩增猪SLA-DRB基因cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a-DRB;将重组表达质粒转化至宿主菌Rosseta中,诱导表达。结果表明,成功扩增出猪SLA-DRB基因cD-NA,经DNA序列测定,所得基因与国外报道的序列99.9%相同;成功构建原核表达载体pET-32a-DRB;经IPTG诱导,表达出了6×His-DRB融合蛋白,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,得到了约50kDa左右蛋白,与预期大小相符,表明猪SLA-DRB基因在大肠杆菌中成功的进行了表达。  相似文献   

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化     

张坤  马丽娟  李刚  黄伟  李伟  贾凤琴 《中国动物保健》2009,11(12):46-51

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。  相似文献   

番鸭细小病毒NS2原核表达载体的构建     

阮二垒  杨丽云  陈芳艳  陈瑞爱  王林川 《中国畜牧兽医》2010,37(4):88-90

根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamH I和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamH I单酶切、BamH I和Sal I双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。  相似文献   

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis     

NIE Xin  ZHAO Tian-jing  CAO Rui-yong  PENG Dong-mei  LI Guo-hua  LI Ya-ying  XU Kai-lian  ZHU Hua-pei  PANG Feng  WANG Feng-yang  DU Li 《中国畜牧兽医》2016,43(7):1681-1687

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.  相似文献   

坏死梭杆菌外膜蛋白基因的克隆与表达     

徐晶  陈立志  刘晓颖  冯二凯  汪孙杰  曹阅 《中国畜牧兽医》2013,40(6):57-60

依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。  相似文献   

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

吴晓薇  徐成刚  马保华  江经纬  叶贺佳  区燕宜  徐小芹  廖明 《中国动物检疫》2011,28(8):46-50

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。  相似文献   

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达     

庞峰  贾晓晓  赵天靖  朱华培  徐开莲  郭莳雨  史巧芸  荣辉  周海龙  王凤阳 《中国畜牧兽医》2014,41(11):54-57

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。  相似文献   

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

陈淑红  李一经  师东方 《畜牧兽医学报》2004,35(4):443-448

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。  相似文献   

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达     

杨小健  李亚颖  庞峰  李国华  彭冬梅  朱姝  聂鑫  曹瑞勇  王凤阳 《动物医学进展》2017,38(3)

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。  相似文献   

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达     

张忠芳  高士争  张曦  李士泽  张玉静 《中国兽医学报》2004,24(5):463-466

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白  相似文献   

水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

谢体三  农微  张新民  黄雅琼  崔奎青  石德顺 《黑龙江畜牧兽医》2009,(8)

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.  相似文献   

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformation Analysis of dhbC Gene of Brucella melitensis     

LI Bao-bao  NIE Xin  YANG Xiao-jian  CAO Rui-yong  ZHU Shu  HUANG Hai-feng  ZHANG Zhen-xing  PENG Dong-mei  LI Guo-hua  LI Ya-ying  WANG Feng-yang  DU Li 《中国畜牧兽医》2017,44(7):1947-1953

This study was aimed to clone and express dhbC gene of Brucella melitensis, and analyze the bioinformatics of its expressed protein. A pair of primers were designed by referring to dhbC gene sequence information of Brucella melitensis M5-90 strain in GenBank, and the dhbC gene fragment was amplified by PCR method. The obtained dhbC gene was ligated into pMD20-T vector to construct pMD20-T-dhbC recombinant plasmid and transformed into E.coli DH5α competent cells. The plasmid was identified by restriction enzyme digestion. The recombinant plasmid pET28a-dhbC was constructed and transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells. The expression was induced by IPTG. The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. Bioinformatics analysis of the amino acid sequence encoded by dhbC gene was carried out using bioinformatics software DNAMAN and related online sites ProtParam, SOPMA and Protscale. The results showed that dhbC gene was cloned with the length of 1 093 bp, and protein expression was expressed. The expressed fusion protein was about 47 ku, and was mainly in the form of inclusion body. The molecular weight of the dhbC protein was C₁₈₆₆H₂₉₆₈N₅₄₄O₅₆₂S₁₅, the molecular mass was 42 496.3 u, the theoretical isoelectric point (pI) was 5.81, the extinction coefficient was 33 835, the instability coefficient was 36.76, the hydrophobic index was 86.19, the total average hydrophobicity (GRAVY) was -0.215. The half-life of reticulocytes in mammals was predicted to be 30 h, and the secondary structure was dominated by α-helix (41.94%) and random coil (31.46%).  相似文献