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1.
利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,分别作为包被抗原,建立了相应的检测H5N1亚型禽流感病毒抗体的ELISA方法。特异性试验、敏感性试验、重复性试验和稳定性试验结果表明,利用3种抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重复性和稳定性,批间和批内变异系数均小于10%,但单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性更好,而且类病毒脂质体有更高的免疫反应性,与灭活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亚型AIV抗体水平检测方面更具有应用前景。 相似文献
2.
为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的. 相似文献
3.
为获得一种针对不同亚型流感病毒的共同保护性抗原,本研究以H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的主要抗原蛋白血凝素(HA)为靶标,以四甘氨酸接头肽替换HA头部结构域,将免疫反应定向至更保守的HA茎部区,同时在HA茎部添加T4折叠三聚体以保护蛋白天然构象,通过杆状病毒表达系统表达头部缺失HA蛋白,并验证其抗原性。结果表明,利用昆虫细胞表达的头部缺失,HA蛋白单一性较好,分子量为47 ku,与CIV全病毒血清抗体可发生特异性结合反应,且头部去除区HA蛋白血清抗体可抑制H1N1和H3N2亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应,中和效价分别为1∶160和1∶320。研究结果为制备针对不同亚型流感病毒(如H1N1和H3N2)的广谱疫苗提供了可能。 相似文献
4.
检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法. 相似文献
5.
从H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,RT-PCR克隆全长血凝素(Hemagglutinin,HA)基因,并进一步克隆HA的主要抗原区HA1基因.将HA1克隆到原核表达载体pGEXKG,与谷胱苷肽(GST)融合表达,表达的融合蛋白GST-HA1以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性处理,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的免疫学活性.ELISA检测发现,GST-HA1只能与H9亚型禽流感病毒抗体发生反应,而与H5和H7亚型禽流感病毒抗体无交叉反应.进一步将纯化的融合蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠,免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体.制备的HA1蛋白特异性强,具有良好的免疫原性,为禽流感病毒的鉴别诊断和禽流感疫苗开发奠定了基础. 相似文献
6.
猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物,从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌中诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot的结果表明,HA基因在大肠埃希菌中获得表达,产物具有免疫学活性,表达蛋白分子质量约为55 ku.表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法.该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好.应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测,结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性,平均为20.5%.在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰,分别高达25.4%、25.0%和35.5%. 相似文献
7.
《中国动物传染病学报》2016,(4)
动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一,本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明,构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后,同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白;转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到2~4血凝价;通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒,为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。 相似文献
8.
《中国动物传染病学报》2016,(2)
本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件:抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1:200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1:40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD_(450)≤0.255和OD_(450)≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD_(450)值的批内变异系数为1.97%~7.85%,批间变异系数为1.94%~6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。 相似文献
9.
为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具. 相似文献
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猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立 总被引：2，自引：3，他引：2
对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。 相似文献
12.
本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒102.63 TCID50/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H2O2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1：3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 相似文献
13.
本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。 相似文献
14.
为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出104 EID50病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。 相似文献
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为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。 相似文献
17.
血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010（H3N2）的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a（+）原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21（DE3）pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2 ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。 相似文献