表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析     

宋菲菲  康震  齐艳君  袁颖烁  张守峰  张乐萃  扈荣良 《畜牧兽医学报》2012,43(9):1449-1454

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。  相似文献   

我国部分城乡犬狂犬病中和抗体水平调查   总被引：6，自引：0，他引：6  

张菲  刘晔  张守峰  曹亮  骆求辉  冯卫权  文武金  凌凤俊  李瑞达  石兴亚  扈荣良 《中国兽医学报》2006,26(6):634-636

以国际兽疫局(OIE)推荐的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对随机采自广东、河北、北京等地区的573份犬血清进行了狂犬病病毒中和抗体效价的测定,以确定犬群中狂犬病的免疫状况。结果显示,在不同地区或不同城市的动物防疫区域中,犬体内狂犬病病毒中和抗体平均水平存在着明显的差异,城市犬的中和抗体水平较高,有的中和抗体保护水平(0.5IU/mL)阳性率高达100%,少数则达不到保护水平,不同防疫区域狂犬病中和抗体水平为(0.08±0.03)~(4.39±1.45)IU/mL,平均保护水平阳性率为46.3%;乡村看家犬病毒中和抗体水平普遍较低,大部分犬体内无中和抗体,只有个别犬体内存在水平较低的中和抗体,平均保护水平阳性率为1.8%。  相似文献   

牛腺病毒载体研究进展     

邱薇  夏咸柱  范泉水  扈荣良  孙阳  杨美峰 《动物医学进展》2003,24(6):11-14

动物腺病毒与人腺病毒具有相似基因组结构 ,用其构建的动物腺病毒载体可将外源基因转移到人体细胞内表达 ,却又不能在其中复制繁殖 ,且人体内不存在针对它们的免疫应答 ,有望代替人腺病毒作为基因治疗和基因免疫的载体 ,目前已构建了多种动物腺病毒载体。文章综述了近年来牛腺病毒载体构建的一些研究进展。  相似文献   

一种改进的简单快速的多位点突变方法   总被引：2，自引：0，他引：2  

张守峰  扈荣良  夏咸柱 《中国兽医学报》2004,24(1):59-61

为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 ,也为其他类似研究提供了一种简单快速的突变方法  相似文献   

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立     

岳军明  扈荣良 《中国兽医学报》1995,(3)

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立我们从已构建的人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）乳腺定位表达载体ｐＳＶＬ－β－Ｐｒｏ－ＵＫ中用ＳａｃＩ＋ＸｈｏＩ回收２．５ｋｂ的大鼠β－乳酪蛋白的启动子及Ｐｒｏ－ＵＫ片段，从ｐＳＶＫ３质粒中用ＳａｃＩ＋ＢａｍＨＩ回收ＳＶ４０...  相似文献   

伪狂犬病病毒TK-/gI-株PK基因转移载体的构建及LacZ基因表达     

袁子国  张秀香  刘全  高胜岩  徐慧娟  张守峰  刘晔  扈荣良 《中国兽医学报》2008,28(4)

伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV(rPRV),且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性.通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TK-/gI-株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响.  相似文献   

狂犬病病毒糖蛋白基因正向重组伪狂犬病病毒（疫苗株TK^-／gI^-）的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

袁子国  张秀香  李修明  王晓虎  高胜言  徐惠娟  张守峰  扈荣良 《中国兽医学报》2008,28(12)

构建以伪狂犬病病毒(PRV)为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组活载体疫苗。采用AseⅠ/MluⅠ切下EG-FP-rgp的表达盒,将其克隆入p8-AA载体的酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8-EGFP/rgp。将该质粒与PRV TK-/gI-基因组在质脂体介导下共转染PK-15细胞,获得PRV-EGFP/rgp重组病毒;通过噬斑克隆对其进行筛选、纯化,并通过RT-PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光对其进行鉴定,并对重组病毒的滴度、外源基因的遗传稳定性及其与亲本病毒株生长特性的关系进行了测定。结果表明:重组病毒的滴度(TCID50)为108.125/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;PRV-EGFP/rgp与亲本病毒PRV TK-/gI-生长趋势差异不显著。通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组PRV的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制提供了新的思路和方法。  相似文献   

腺病毒载体的研究进展与展望   总被引：2，自引：0，他引：2  

袁子国  张秀香  高胜言  徐慧娟  扈荣良 《吉林畜牧兽医》2008,29(1):13-15

随着重组技术在生物领域上的应用,病毒活载体疫苗的研制成为基因工程疫苗研制的热点,其中,腺病毒由于其具有独特的优势,成为疫苗载体应用中的不可缺少部分,本文就腺病毒载体的研究进展作一简要综述,旨在为其进一步应用提供参考依据。  相似文献   

狂犬病病毒糖、核蛋白基因疫苗的构建及在小鼠的免疫试验   总被引：5，自引：1，他引：5  

袁慧君  扈荣良  包世俊  张守峰  殷震 《中国兽医学报》2004,24(2):141-144

分别以 p IRES1neo和 p VAX1为载体 ,构建了以狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白为目的基因的基因疫苗单或双基因表达载体。以司苯 -甘油作为包裹剂 ,按 1μg DNA用 0 .5μL司苯 -甘油比例混合 ,将各表达载体制成 DNA疫苗 ,进行小鼠免疫试验。免疫共分 p IRES1neo、p IG- neo、p IN- neo、p IGN、p IG- neo p IN- neo、p VAX1、p VG、p VN和 p VGN9个试验组 ,每只小鼠于后肢胫前肌每侧接种基因疫苗 5 0μL (0 .5 g/ L ) ,共免疫 3次 ,间隔 14 d。通过间接 EL ISA和细胞中和指数测定分别检测免疫应答水平。结果显示 ,1免疫 3次后 ,所有试验组抗体阳转率 10 0 % ;2第 3次免疫后 14 d检测 ,抗体水平显著上升 ;3以 p IRES1neo为载体构建的基因疫苗免疫效果普遍优于以 p VAX1为载体构建的基因疫苗 ,其中含有糖蛋白 /核蛋白双基因共表达载体 p IGN免疫组的抗体水平均高于其他试验组 ;4以 7.5个 L D50 的 CVS强毒肌肉攻毒 ,保护率达 89%。通过以上试验证明 ,p IGN是用于本动物免疫试验的最佳 DNA疫苗。  相似文献   

非洲猪瘟病毒沈阳分离株p30基因的克隆及其亲水区的原核表达     

王永志  安鼎杰  李小宇  李忠鹏  张静远  张守峰  扈荣良  赵玉民 《吉林农业科学》2019,44(1):40-43

2018年中国首次发生了非洲猪瘟疫情。本研究从来源于沈阳地区的1个非洲猪瘟病毒(African swine fever vi?rus, ASFV)分离株中克隆了p30基因(GenBank No. MK482370)。序列分析发现,该基因与安徽分离株相同(GenBank No.MK128995),而与已报道的沈阳分离株SY-18株(GenBank No. MH766894)不同,新克隆的p30基因全长585 bp,编码194个氨基酸,而SY-18株p30基因全长606 bp,编码201个氨基酸。该结果提示,我国的ASFV存在基因变异或者传播来源复杂,流行病学分析应关注该基因,不同毒株的致病力有待深入研究。本研究利用pGEX-6p-1表达系统成功表达了p30基因的亲水区;通过Ni-NTA-琼脂糖亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,获得了纯度较高的重组蛋白,为ASFV的血清学监测提供了抗原。  相似文献