传染性法氏囊病病毒株VP2基因在重组腺病毒中的表达     

潘群兴  王永山  何孔旺  欧阳伟  王晓丽  王忠灿  唐雨德 《中国兽医学报》2010,30(3)

用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。  相似文献   

传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响     

欧阳伟  王永山  王晓丽  夏兴霞  潘群兴  毕振威  诸玉梅  董晨红  张海彬 《中国预防兽医学报》2015,(2):83-88

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别采用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的m RNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2 h到24 h内,ch MDA5、ch TLR3、ch LGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225 000和18 700倍。当采用si RNA分别敲除DT40细胞中ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2 h到24 h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,ch MDA5和ch TLR3的表达显著降低,而ch LGP2表达无显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了PRRS ch MDA5和ch TLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。  相似文献   

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析     

朱向东  王永山  欧阳伟  潘群兴  毕振威  李月华  范红结  王笑梅 《中国兽医学报》2014,(2):219-226

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3 260bp、B节段长度2 827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8%⁹8.1%和96.9%98.1%和96.9%⁹8.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%98.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%⁹0.4%和90.0%90.4%和90.0%⁹0.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段77790.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777⁷82位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnⅠ酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。  相似文献   

益母草水煎剂对家兔离体子宫运动性能的影响     

应如海  潘群兴  丁绯 《中兽医医药杂志》2003,22(4):10-12

采用离体器官实验法 ,将不同状态下的家兔离体子宫置于恒温通气麦氏浴皿培养液中 ,向麦氏浴皿中逐次加入等量不同浓度的益母草水煎剂。通过 BL - New Century生物信号采集处理系统 ,扫描记录子宫平滑肌张力变化情况 ,观察益母草水煎剂对家兔离体子宫运动性能的影响 ,并探讨其作用机理。结果 :益母草水煎剂在浓度为 0 .2 5～ 1.0 0 g/ ml时 ,子宫平滑肌张力随浓度增大而增大 ;益母草水煎剂对怀孕家兔离体子宫的平滑肌收缩作用比空怀家兔离体子宫的平滑肌收缩作用显著 (P<0 .0 1) ,对怀孕家兔经己烯雌酚处理的离体子宫的平滑肌收缩作用比未经己烯雌酚处理的离体子宫平滑肌收缩作用显著 (P<0 .0 1) ;而对空怀家兔是否经己烯雌酚处理时的子宫平滑肌收缩作用差异不显著 (P<0 .0 5 )。结论 :益母草水煎剂对不同状态下的家兔离体子宫平滑肌收缩均有增强作用。  相似文献   

两株猪圆环病毒2型病毒的分离鉴定及其序列分析     

郭容利  何孔旺  钟书霖  温立斌  潘群兴 《江苏农业学报》2009,25(5)

利用PK15细胞从猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)临床发病与死亡猪中分离到2株病毒;分别命名为Haian(登录号为FJ712216)和Xuancheng(登录号为FJ712215).利用间接免疫荧光(IFA)和聚合酶链式反应(PCR)对其进行鉴定,并对其全基因组序列进行了测定和分析.结果表明,分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核中,2分离株的基因组全长为1 767 nt,与世界上其他地区的PCV2分离株密切相关,核苷酸序列同源性达93.7%～97.7%,属于毒力较强的Genotype 1.  相似文献   

重组外源基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建与鉴定     

潘群兴  何孔旺  王永山  温立斌  茅爱华  郭容利 《畜牧兽医学报》2008,39(9)

将猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒（PPV）VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒（rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap）。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 ku的特异性带,表明rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap在HEK-293细胞中成功地表达了PPV∶VP2和PCV2∶Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合PPV∶VP2-PCV2∶Cap蛋白具有与PPV全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合PPV∶VP2-PCV∶Cap蛋白的粗提物,发现可自行装配成许多病毒样粒子[PPV∶VLP（PCV2）]。  相似文献   

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE与fliC基因的表达及鉴定     

潘群兴  王永山  刘洁  夏兴霞  何孔旺  张雪寒 《江苏农业学报》2009,25(3)

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157:H7 的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在E.coli BL21(DE3)中表达.结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在E.coli BL21(DE3)中表达的rfbE、fliC具有良好的免疫活性.  相似文献   

重组表达口蹄疫病毒T细胞表位猪细小病毒病毒样颗粒的制备   总被引：2，自引：0，他引：2  

潘群兴  王永山  何孔旺  欧阳伟  王晓丽  诸玉梅  夏兴霞 《中国预防兽医学报》2010,32(11)

为增强表位疫苗的免疫原性,本研究将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1中编码T细胞表位肽(aa 21～aa 40)序列连接于猪细小病毒(PPV)VP2的5'端,并插入到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中,构建成重组转座载体pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV-VP1-PPV-VP2,转染昆虫草地夜蛾(Sf9)细胞,并在Sf9中进行了表达。电镜观察显示,表达的重组蛋白能够自我组装成病毒样颗粒rPPV∶VLP(FMDV)。用间接免疫荧光试验(IFA)、western blot分析表明,表达产物具有与PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫实验证实,在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应;而且该病毒样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反应。  相似文献   

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析     

朱向东  王永山  欧阳伟  潘群兴  毕振威  李月华  范红结  王笑梅 《兽医大学学报》2014,(2):219-226

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）,分别命名为QL和ZZ—ll,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96．8％～98．1％和96．9％～98．4％,处在IB—DV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89．7％～90．4％和90．0％～90．7％,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ—11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777～782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ—11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。  相似文献   

猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立     

潘群兴  何孔旺  段治涛  黄克和 《江苏农业学报》2007,23(6):588-592

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列设计特异性引物,进行PCR反应,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达.表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10 mg/ml.以1.8 μg/ml蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法.建立的ELISA方法与北京世纪元亨公司试剂盒比较,两者检测结果符合率达85%以上.用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10～160日龄猪群血清样品进行了检测,检测结果显示母猪阳性率为81.4%,仔猪阳性率随着日龄的增加而逐渐降低,之后由于受PCV-2的感染,阳性率逐渐升高.本试验建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV-2抗体的大规模检测.  相似文献