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为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。 相似文献
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【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。 相似文献
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2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV（HP-PRRSV）参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位（primary neutralizing epitope,PNE）都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。 相似文献
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【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素（cat）选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H（△IMPDH）对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H（△IMPDH））对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108 CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108 CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H（△IMPDH）,并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。 相似文献
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猪感染类猪圆环病毒因子P1后血小板的变化 总被引：1，自引：0，他引：1
探讨类猪圆环病毒因子P1感染对广西巴马小型猪血小板参数的影响。将12头30日龄的广西巴马小型猪随机、平均分成两组．实验组经腹股沟淋巴结途径接种类猪圆环病毒因子P1的分子克隆。采用自动血液分析仪检测接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血血小板参数。统计分析显示猪感染P1后,与对照组相比。实验组的血小板平均体积（MPV）无显著差异,而血小板计数（PLT）和血小板压积（PCT）在接种后8d明显降低,血小板体积分布宽度（PDW）在接种后17d显著降低。 相似文献
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为了了解次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)对猪链球菌2型GN061215致病力的影响机制,利用同源重组技术,敲除猪链球菌2型GN061215的impdh基因,重组后的GN061215命名为GN061215(△IMPDH),比较GN061215与GN061215(△IMPDH)培养特性、生化特性、致病力以及基因转录水平差异。结果显示impdh基因敲除后,引起GN061215生长曲线迟缓期延长,降低了GN061215生长曲线平台期OD600峰值,同时截短了GN061215菌株成链长度;GN061215、GN061215(△IMPDH)对46种代谢底物利用能力一致,对2种代谢底物利用存在差异;GN061215(△IMPDH)对Balb/c小鼠的致病力较GN061215菌株有一定程度的下降。SDS-PAGE显示GN061215(△IMPDH)菌体的粗提蛋白质条带较GN061215有显著减少;基因芯片比较GN061215、GN061215(△IMPDH)基因转录差异发现,下调基因中存在36个关联核糖体大、小亚基合成的基因,而在上调基因中不存在该类基因,表明impdh基因的丢失影响了GN061215菌株核糖体大、小亚基的合成,进而显著减少了GN061215菌株菌体蛋白质的表达,这可能与GN061215菌株毒力的下降有关。 相似文献
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为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。 相似文献
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为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10~8 CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10~9 CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。 相似文献