鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备   总被引：5，自引：0，他引：5  

丁忠庆  刘胜旺  孔宪刚  宋铭忻 《中国兽医学报》2004,24(3):255-257

将克隆得到的鸡 IFN- γ基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体 p PROEXTMHT的 Pst 和 Kpn 位点上 ,构建了重组表达质粒 p PROEXTMHT- IFN -γ,经序列分析鉴定 ,确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 α,于 37℃不同时间诱导培养 ,SDS- PAGE电泳表明 ,该基因在大肠杆菌中发生高水平表达 ,表达的鸡 IFN- γ融合蛋白相对分子质量约为 2 2 0 0 0。重组蛋白占菌体总蛋白的 33%。经 Western blot鉴定 ,该重组蛋白质具有生物学活性。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IFN- γ融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射于新西兰白兔 ,制备了兔抗鸡 IFN- γ多克隆抗体。琼脂扩散结果表明 ,多克隆抗体可与纯化的鸡IFN -γ重组蛋白发生特异性反应  相似文献   

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析     

王春来  刘思国  王牟平  彭永刚  宫强  孔宪刚 《中国预防兽医学报》2006,(1)

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。  相似文献   

新城疫病毒La Sota株F蛋白结构与部分功能区的预测     

张晓东  刘怀然  刘培欣  闫丽辉  刘胜旺  孔宪刚 《中国预防兽医学报》2007,29(12):938-942

以新城疫病毒(Newcastlediseace virus,NDV)La sota F蛋白的氨基酸序列为基础,采用Chou-Fasman法、Garnier-Robson法、Karplus-Schulz法与Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分别预测蛋白质的二级结构和B细胞抗原表位。预测结果表明,NDV La Sota F蛋白结构较为复杂,含有较多的α-螺旋、β-折叠区,转角和无规则卷曲等有柔韧性区域。此外,应用Tmap法预测了NDV La sota F蛋白的跨膜区域,通过同源建模的方法预测了该蛋白的三维空间结构,并比较了强弱毒株裂解位点处空间结构的不同。为进一步通过试验方法确定其蛋白的B细胞表位和从结构出发了解其生物学功能,提供了理论依据。  相似文献   

马传贫病毒单克隆抗体的研究   总被引：1，自引：1，他引：0  

卢景良  孔宪刚  李节棠  王振生  林秀英 《中国农业科学》1985,18(5):76-81

Khler 和 Milstein[1]首先发现,骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合,可形成杂交瘤细胞系,能分泌单克隆抗体(McAb)。它所产生的抗体特异性强,滴度高[2]。这项技术建立仅几年的时间,但已广泛用于生物学医学和农牧业等许多领域的研究,并取得了很大进展[3-8]。McAb 在畜禽疫病的快速诊断、抗原分析和提纯、病原体的株间鉴別、疫苗检验和制造、流行病学研究及其它基础理论研究等、都甚急需。Ron Cox[9]预计至  相似文献   

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达     

孔宪刚  孙荣芳 《中国预防兽医学报》1999,21(6):419-422

根据美国马传染性贫血病病毒（EIAV）Wyoming株基因序列,设计扩增EIAVgag和p26基因的引物,用PCR法能忠实的分别扩增出全长gag和p26基因。经用杆状病毒表达系统对所获gag和p26基因进行克隆和重组,获得了高效稳定表达Gag和p26蛋白的重组杆状病毒（rBVs）。含有gag和p26基因的重组杆状病毒感染昆虫Sf21细胞,经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化,每升培养物能获得2mgCag或12mgp26蛋白。  相似文献   

鸡细胞因子研究进展   总被引：18，自引：0，他引：18  

刘胜旺  孔宪刚  卢景良 《中国预防兽医学报》2000,22(6):474-476

与人类和哺乳动物比较,以鸡为主的非哺乳动物细胞因子的研究不但在研究鸡免疫系统的发生及其免疫调节机理中具有重要作用,而且在与人类和哺乳动物的比较免疫学、生物发育和进化的研究中具有重要意义。本文从发现、生物学特性及分子特征等方面对鸡白细胞介素－１、６、８、骨髓单核细胞生长因子、转移生长因子－β家族、肿瘤坏死因子－α、干细胞因子等已取得一定研究进展的鸡细胞因子作以下综述。  相似文献   

编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定     

张宝山  孙成群  刘相冬  刘永刚  周家喜  王凯波  刘建华  孔宪刚 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

ＥＩＡＶ在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节,其中Ｒｅｖ蛋白是病毒编码的转录后调节因子,决定了病毒复制由早期到晚期的过渡。Ｒｅｖ是非结构蛋白,由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物,在病毒繁殖早期提取细胞总ＲＮＡ,反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析,和与基因组全序列的比较,确定了编码Ｒｅｖ蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。  相似文献   

马传染性贫血野毒辽宁株前病毒全基因组核苷酸序列测定     

刘红全  王柳  童光志  杨志彪  仇华吉  孔宪刚  智海东  李昌文 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

采取马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）辽宁野毒株（Ｌ株）感染马的血液,分离白细胞。提取白细胞中的ＤＮＡ,并以此为模板,利用ＰＣＲ技术分四个片段扩增 ＥＩＡＶ前病毒 ＤＮＡ。将其分别克隆到载体质粒 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中,经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接,得到 ＥＩＡＶ　 Ｌ株前病毒基因组全序列。  相似文献   

新城疫病毒F48E9株及东北地区流行株F基因遗传变异分析   总被引：16，自引：4，他引：12  

曹殿军  苑纯秀  郭鑫  闵平  孔宪刚  卢景良 《中国兽医学报》2000,20(2):117-120

采用异硫氰酸胍／酚／氯仿抽提一步法,提取新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９株及２个东北地区分离株ＤＢ３、ＤＢ５基因组ＲＮＡ,并以其为模板经反转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第１链,再利用ＰＣＲ技术分段增出Ｆ基因的ｃＤＮＡ。Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和ＤＢ５株Ｆ基因的ｃＤＮＡ经酶切修饰后,插入ｐＵＣ１９的多克隆位点中,转化感受态Ｅ。ｃｄｉ ＤＨ５ａ,经相对分子质量比较、酶切分析及ＰＣＲ等鉴定方法筛选出Ｆ４８Ｅ９、ＤＢ３和  相似文献   

马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析     

刘红全  王柳  杨志彪  孔宪刚  童光志 《中国农业科学》2001,34(6):690-696

 本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中，得到 ４个重组质粒ｐ２．８、ｐ２．４、ｐ３．１和 ｐ１．２，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到 ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全序列。ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全长 ８２３５ｂｐ，其中 Ｇ＋Ｃ含量为 ３８％。通过使用计算机软件ＤＮＡＳＩＳ分析，ＥＩＡＶ－Ｌ与马传贫驴强毒和马传贫驴白细胞疫苗毒序列同源性分别为９８．４％和９６．９％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外 ＥＩＡＶ－Ｌ与驴强毒的同源性高于其与驴白细胞弱毒疫苗株的同源性，这符合驴白细胞弱毒疫苗株的衍生过程。基因组两端是长为３１６ｂｐ的ＬＴＲ，其中Ｕ３为１９７ｂｐ，Ｒ为８０ＢＰ，Ｕ５为３９ｂｐ。前病毒基因组有 ３个较大的开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码 ｇａｇ、ｐｏｌ和 ｅｎｖ基因。ｇａｇ基因位于 ７１３～１９１２位碱基之间，全长１２００ｂｐ；ｐｏｌ基因位于 １７０８～５１０９位碱基之间，全长  相似文献