羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析     

聂鑫  赵天靖  曹瑞勇  彭冬梅  李国华  李亚颖  徐开莲  朱华培  庞峰  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2016,43(7):1681-1687

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。  相似文献   

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

李宝宝  张振兴  黄海峰  张萌萌  郑义盈  王成强  章泸尹  安琪  杨小健  聂鑫  曹瑞勇  朱姝  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2019,46(1):28-36

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C₁₀₀₇H₁₅₆₇N₂₅₇O₂₈₃S₃，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。  相似文献   

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

李宝宝  张振兴  黄海峰  张萌萌  郑义盈  王成强  章泸尹  安琪  杨小健  聂鑫  曹瑞勇  朱姝  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2019,(1):28-36

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列(登录号:CP007040.1),使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物,选取高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段,并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增产物约为615bp,编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高,而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现,ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3,分子质量为21.90ku,理论等电点(pI)为9.16,属碱性蛋白质,疏水指数为96.57,总平均疏水性(GRAVY)为0.173(>0),属于疏水类蛋白;前21位氨基酸为信号肽,第5-27位氨基酸区域存在1个跨膜区,存在N-糖基化位点及磷酸化位点,不存在O-糖基化位点,具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位;二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%;三级结构是呈β-桶状的单聚体,隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。  相似文献   

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

安琪  黄海峰  张振兴  李宝宝  张萌萌  郑义盈  王成强  章泸尹  杨小健  曹瑞勇  聂鑫  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2018,(8)

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a(+)载体相连,构建pET-28a(+)-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645bp的目的片段,并表达出大小约28ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07(GenBank登录号:CP007040.1)和Pm70(GenBank登录号:AE004439.1)株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87(40),在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30h,疏水指数为82.15,总平均疏水性(GRAVY)为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。  相似文献   

羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因的克隆、原核表达及生物信息学分析     

黄海峰  王成强  张振兴  李宝宝  郑义盈  安琪  张萌萌  章泸尹  朱姝  曹瑞勇  杨小健  聂鑫  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2018,45(12):3337-3345

试验旨在对羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因进行克隆、原核表达及纯化,并对表达蛋白toxA-N进行生物信息学分析,为探索羊源多杀性巴氏杆菌毒素基因的相关特性提供参考依据。以羊源多杀性巴氏杆菌基因组为模板,参考GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌HN06中toxA基因序列（登录号：CP003313.1）设计引物,通过PCR技术扩增出目的片段,构建重组质粒pET28a （+）-toxA-N,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达后,经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定,纯化蛋白并运用生物信息学软件对表达蛋白进行特性分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 515 bp的toxA-N基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到大小约为5 369和1 515 bp两条片段,表明成功构建了pET28a （+）-toxA-N重组质粒,IPTG诱导表达的菌株经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定后,成功表达出大小约为60 ku的toxA-N蛋白;生物信息学分析表明,toxA-N蛋白为包涵体,其分子式为C₂₆₃₅H₄₀₀₂N₆₆₄O₇₉₇S₁₇,原子总个数为8 115,消光系数为84 480,不稳定指数为43.50,亲水性平均值为-0.381。在toxA-N蛋白二级结构中,α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占53.47%、2.77%、11.28%和32.48%,与三级结构预测结果一致。本试验通过对toxA-N基因的初步研究,揭示了多杀性巴氏杆菌毒素的相关特性,对家畜的疾病预防、诊断、治疗具有重要意义。  相似文献   

羊口疮病毒ORF059基因的真核表达研究     

朱姝  庞峰  李国华  李亚颖  彭冬梅  杨小健  聂鑫  曹瑞勇  王凤阳  杜丽 《中国畜牧兽医》2016,43(9):2291-2295

试验旨在扩增羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,测序正确后瞬时转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果表明,ORF059基因片段大小为1 005 bp;重组质粒pEGFP-ORF059-N1构建正确;转染pEGFP-ORF059-N1的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光;表达的融合蛋白大小约为64 ku。本试验结果为进一步研究ORF059的作用机理奠定了基础。  相似文献   

羊源雷氏普罗威斯登菌的分离鉴定     

曹瑞勇  聂鑫  李国华  杜丽  王凤阳 《现代畜牧兽医》2018,(6)

为了分离鉴定海南某养殖场黑山羊流鼻液、打喷嚏这一临床症状可能的致病菌,试验通过对病羊鼻拭子的无菌采集、病原菌分离培养后,利用革兰氏染色、细菌生化反应、细菌16S r RNA通用引物进行PCR反应等方法对分离得到的菌株进行鉴定。结果表明:对病羊鼻拭子培养后,得到的菌落形态一致;通过染色发现该菌为短杆状革兰氏阴性菌,进一步鉴定该菌为雷氏普罗威登斯菌。可引起海南黑山羊呼吸道疾病,为相应疾病的诊断和治疗奠基了一定的基础。  相似文献   

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析     

安琪  黄海峰  张振兴  李宝宝  张萌萌  郑义盈  王成强  章泸尹  杨小健  曹瑞勇  聂鑫  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2018,45(8):2067-2075

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C₁₀₈₅H₁₆₅₁N₂₉₃O₃₀₉S₉,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。  相似文献