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羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。 相似文献
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本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
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本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C_(1684)H_(2619)N_(457)O_(505)S_3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 相似文献
4.
根据GenBank中发表的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)外膜蛋白H(ompH)基因的核苷酸序列,设计合成了一对特异性引物ompH3,用PCR方法扩增了1株禽源多杀性巴氏杆菌野生菌株(P1004)的ompH基因.然后将获得的928 bp的目的基因片段连接到pMD18-T载体上,进行多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析.结果表明,P1004和标准菌株C47-8的ompH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为62％和91.7％,与已知的9个国内外代表株进行比对分析,核苷酸序列的同源性在55.9％～65.2％之间,氨基酸序列的同源性在91.3％～91.7％之间,说明P1004的ompH基因序列与C47-8以及国内外代表株之间有明显差异,即变异明显,揭示了禽源多杀性巴氏杆菌的ompH基因与其他菌株的分子进化关系,为ompH基因应用于疫苗的可行性奠定了基础. 相似文献
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猪源多杀性巴氏杆菌荚膜分型及外膜蛋白H基因序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解国内猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况及与荚膜型之间的相关性,本试验采用PCR方法对44株猪源多杀性巴氏杆菌进行荚膜分型和ompH基因的扩增测序。结果显示,44株菌株中22株为荚膜A型,17株为荚膜B型,5株为荚膜D型;44株菌株的ompH基因开放阅读框在1 002~1 056bp之间;SignaIP 4.1预测结果显示,信号肽为N端20个氨基酸残基;ProtParam分析结果显示,成熟蛋白氨基酸残基数量在313~331aa之间,推测的分子质量在33.83~36.46ku之间。序列分析结果显示,44株菌株核苷酸同源性为86.2%~100.0%,氨基酸同源性为86.0%~100.0%;ompH基因核苷酸序列遗传进化树结果显示,荚膜A型、B型和D型菌株分别在不同的分支。试验结果表明,猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性,与荚膜型之间存在相关性。 相似文献
6.
根据GenBank 上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5 基因的核苷酸序列,设计1 对特异性引物,对贵州省HPS 分离株OMP5 基因进行扩增。结果表明所扩增的OMP5 基因的长度为1116 bp,与SH0165 株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为100%。生物信息学分析结果表明,OMP5 基因所编码的外膜蛋白P5 的理论等电点pI为9.34,不稳定系数为20.44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83.94,总体平均亲水性为-0.172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21 个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22 个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。 相似文献
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根据GenBank上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物,对贵州省HPS分离株OMP5基因进行扩增。结果表明所扩增的OIvIP5基因的长度为1116bp,与SH0165株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为lOO％。生物信息学分析结果表明,OMP5基因所编码的外膜蛋白P5的理论等电点pl为9．34不稳定系数为20．44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83．94,总体平均亲水性为-0．172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。 相似文献
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根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌（HPS）全基因组序列中的外膜蛋白OMP2基因的核苷酸序列,利用Premier Primer5.0和Oligo6.0软件设计1对特异性引物,对从贵州省分离的HPS的OMP2基因进行扩增、克隆、测序和生物信息学分析。测序结果比表明,扩增的HPS分离菌株目的基因长度为1092bp,共编码363个氨基酸,与GenBank上公布的SH0165株（NC011852）中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性100%。生物信息学分析结果表明,OMP2外膜蛋白的分子质量为39087.45Daltons,理论等电点pI为9.21,不稳定系数为16.73,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为70.63,总体平均亲水性为-0.494,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈散在分布,有8个主要的抗原表位;OMP2外膜蛋白序列最前端的19个N-末端氨基酸残基为信号肽序列,最佳切割位点在19～20个氨基酸,且信号肽区域主要为疏水性氨基酸;该蛋白无跨膜区;预测OMP2外膜蛋白可能含有4个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、9个N-肉豆蔻酰化位点。 相似文献
9.
《中国畜牧兽医》2018,(12)
试验旨在对羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因进行克隆、原核表达及纯化,并对表达蛋白toxA-N进行生物信息学分析,为探索羊源多杀性巴氏杆菌毒素基因的相关特性提供参考依据。以羊源多杀性巴氏杆菌基因组为模板,参考GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌HN06中toxA基因序列(登录号:CP003313.1)设计引物,通过PCR技术扩增出目的片段,构建重组质粒pET28a(+)-toxA-N,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后,经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定,纯化蛋白并运用生物信息学软件对表达蛋白进行特性分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 515bp的toxA-N基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到大小约为5 369和1 515bp两条片段,表明成功构建了pET28a(+)-toxA-N重组质粒,IPTG诱导表达的菌株经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定后,成功表达出大小约为60ku的toxA-N蛋白;生物信息学分析表明,toxA-N蛋白为包涵体,其分子式为C2635H4002N664O797S17,原子总个数为8 115,消光系数为84 480,不稳定指数为43.50,亲水性平均值为-0.381。在toxA-N蛋白二级结构中,α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占53.47%、2.77%、11.28%和32.48%,与三级结构预测结果一致。本试验通过对toxA-N基因的初步研究,揭示了多杀性巴氏杆菌毒素的相关特性,对家畜的疾病预防、诊断、治疗具有重要意义。 相似文献
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为了解国内不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况,采用PCR方法对16株不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增测序和分析。结果显示：16株菌株的ompH基因开放阅读框在1002～1056 bp之间;信号肽为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在313～331 aa之间,氨基酸同源性为82.1%～100%;基于ompH氨基酸序列的系统发育树中鸡源菌株（荚膜A型）、猪源和牛源菌株（荚膜B型）分别在不同的分支。序列分析结果表明,ompH基因序列差异与荚膜型之间存在相关性,而与毒力大小无相关性。 相似文献
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试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C2735H4428N786O855S16,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。 相似文献
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为探讨小清蛋白(PV)在成年摇晃小鼠海马中的表达情况,用免疫荧光组织化学法对野生型小鼠(R+/+)、杂合子摇晃小鼠(R+/-)、纯合子摇晃小鼠(R-/-)海马CA1区、CA3区、齿状回中PV的分布和表达进行研究。结果表明,PV在摇晃小鼠海马CA1区、CA3区和齿状回中均有分布,主要表达于CA1区和CA3区的锥体细胞层及齿状回的颗粒细胞层。与野生型相比,杂合子摇晃小鼠CA1区PV阳性细胞数显著降低(P<0.01),而纯合子摇晃小鼠增加;CA3区和齿状回中的PV阳性细胞数均降低,但纯合子摇晃小鼠高于杂合子摇晃小鼠。提示摇晃蛋白(Reelin)影响PV的表达,且PV的表达异常可能与摇晃小鼠的表现型有关。 相似文献
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为了解海南地方猪TLR2基因的多态性,本研究采用PCR法从五指山猪、临高猪和屯昌猪3种海南地方猪的血液中克隆Toll样受体2(TLR2)基因,并进行测序及序列分析。结果显示,3种海南地方猪TLR2基因的扩增长度均为2649bp,编码区长2358bp。3种猪TLR2基因序列的种内比对结果显示,五指山猪种内有7个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;屯昌猪种内有5个核苷酸位点存在多态性,均在编码区外;临高猪种内有4个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。种间比对结果显示3种猪有12个核苷酸位点存在多态性,其中3处为错义突变,导致氨基酸改变。同源性分析结果显示,3种猪的TLR2基因序列高度保守,同源性在99.6%~99.9%之间。蛋白质结构预测分析显示,海南猪TLR2基因在876、1454位点呈现的AG突变均引起了其蛋白质二级结构和三级结构的改变,提示可能存在TLR2功能的变化。本研究填补了海南地方猪TLR2基因多态性空白,为深入研究TLR2基因多态性与猪疫病易感性的关系提供基础研究资料。 相似文献
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为研究日粮粗纤维水平对定安鹅生产性能及器官指标的影响,试验选取遗传背景一致、体重相近[(1384.33±0.76)g]的28d定安鹅120只,随机分为3个处理组,每个处理组设4个重复,每个重复10只。分别饲喂粗纤维水平为4.29%、5.29%和6.29%的日粮。试验期为35d。结果表明:(1)5.29%粗纤维组末重和日增重较6.29%粗纤维组分别提高13.57%和27.95%(P<0.05);5.29%粗纤维组采食量比4.29%和6.29%粗纤维组提高5.72%和7.95%(P<0.05);5.29%粗纤维组料重比较6.29%粗纤维组降低16.05%(P<0.05)。(2)5.29%粗纤维组屠宰率、半净膛率、腿肌率和胸肌率分别比4.29%和6.29%粗纤维组分别提高1.64%和2.28%、0.38%和1.03%、0.51%和9.45%、4.31%和6.84%(P>0.05)。腹脂率随着粗纤维水平的提高有下降的趋势(P>0.05)。(3)与4.29%和6.29%粗纤维组相比,5.29%粗纤维组心、肝、胃、肌胃及脾脏指数分别提高5.31%和2.43%、6.15%和5.03%、10.45%和7.29%、11.45%和7.94%、1.65%和2.50%(P>0.05)。综合认为,5.29%粗纤维可使35~70d定安鹅获得较优的生产性能。 相似文献
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本试验旨在探讨不同来源的猪空肠液在消化酶纯化过程中活性回收率的差异,为体外仿生消化酶试剂的制备提供参考。试验采用2×2两因素完全随机设计,包括2个生长阶段[生长期(60~100日龄)和育肥期(101~140日龄)]和2种饲粮类型[玉米-豆粕型饲粮和玉米-玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)-米糠粕型饲粮]。每个生长阶段采用2×2完全交叉设计,将8头安装有空肠T型瘘管的“大×长”二元杂交去势公猪随机分为2组,每组4头猪。在每个生长阶段各进行2期试验,交叉饲喂2种饲粮,形成每个处理8头猪(重复)。每期试验包括10d预试期和3 d空肠液收集期。待每期试验结束后将每头猪空肠液混合,然后采用无水乙醇沉淀法纯化空肠液中的消化酶,测定纯化过程中消化酶活性的损失和回收率。结果表明:1)不同来源空肠液经冰乙醇沉淀-复溶后获得的消化酶活性的回收率间无显著差异(P>0.05),且回收率均在70%以上;2)不同来源空肠液经冰乙醇沉淀-复溶-冻干后获得的消化酶活性的回收率也均无显著差异(P>0.05),且回收率均在60%以上;3)冰乙醇沉淀-复溶过程中消化酶活性的损失极显著高于冻干过程(P<0.01)。综合以上结果,不同生长阶段和饲粮类型下获得的猪空肠液在纯化过程中消化酶活性的回收率均无显著差异,且通过无水乙醇沉淀法可以获得满意的回收率。 相似文献
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为有效实现山羊基因组选择,提高选择准确性,根据前期对内蒙古绒山羊生产性能的遗传评估结果,以山羊的体重(h2=0.11)性状为例,结合NCBI已经公布的山羊基因组序列信息,设定群体传递过程和基因组参数,模拟获得个体表型和基因型数据,利用GBLUP和Bayes方法进行基因组育种值估计。结果表明,不同历史群体变化模式下,基因组选择对山羊体重基因组育种估计值准确性无显著影响(P>0.05)。GBLUP法估计的准确性高于Bayes Lasso,准确性达0.40。在历史群体下降模式下,基因组选择准确性高于恒定模式。 相似文献
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旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得SCAP基因沉默稳转细胞株,采用Real-time PCR和Western blot观察基因沉默细胞株中SCAP基因和蛋白的表达,尼罗河红和油红O染色脂滴检测SCAP基因沉默及SCAP质粒瞬时转染对细胞脂滴形成的影响。结果表明,本研究成功构建了奶牛SCAP基因沉默慢病毒重组载体,感染细胞后经过5 mg·L-1嘌呤霉素筛选得到SCAP基因沉默稳转细胞株。基因检测发现,各个沉默细胞株的SCAP基因表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,RNAi-SCAP3细胞中的SCAP蛋白表达降低为对照组的0.49倍(P<0.05),脂代谢基因SCD和FAS表达也显著下降(P<0.05)。脂滴染色发现,RNAi-SCAP3沉默细胞株的脂滴含量显著低于对照组细胞(P<0.01),脂滴直径≤2.0μm的小脂滴个数增多,而直径≥2.5μm的大脂滴个数减少;将SCAP真核表达载体瞬时转染RNAi-SCAP3细胞株后发现,SCAP基因的过表达显著减少了细胞中小脂滴比例而增加了大脂滴比例(P<0.05)。本研究成功构建了SCAP基因沉默稳转细胞株,发现SCAP的表达影响了细胞脂滴直径的大小。 相似文献
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用改进水提醇沉法提取银杏叶多糖。用灭活的传染性法氏囊超强毒(vvIBDV)GX8/99细胞适应株分别制备不同质量浓度(40,20,10 g/L)银杏叶多糖佐剂疫苗、弗氏不完全佐剂疫苗和无佐剂疫苗。360只SPF公雏鸡随机均分为6组,其中5组SPF鸡分别免疫上述5种疫苗,另外1组SPF鸡不免疫作为阴性对照。检测IL-2和IFN-γ分泌量、血清抗体、外周血淋巴细胞转化率、外周血CD4^+和CD8^+T淋巴细胞数量等用来评价疫苗的免疫效果。38日龄进行攻毒试验,评价疫苗的保护效果。结果显示,银杏叶多糖佐剂疫苗组各免疫指标均显著高于弗氏佐剂和无佐剂疫苗组(P<0.05);40 g/L银杏叶多糖佐剂疫苗组免疫效果最好,但与20 g/L银杏叶多糖佐剂疫苗组差异不明显,并且2组攻毒保护率无显著性差异。结果表明,银杏叶多糖作为vvIBDV疫苗佐剂具有良好的免疫促进作用,且20 g/L的银杏叶多糖即可达到最佳效果。 相似文献
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本试验旨在研究饲料中添加丙氨酰-谷氨酰胺二肽(AGD)对黄颡鱼幼鱼生长性能、抗氧化能力、免疫应答能力及抗逆能力的影响。以平均体重为(1.98±0.01)g的黄颡鱼幼鱼为研究对象,随机分成5组,每组3个重复,每个重复30尾鱼,分别投喂添加0(对照)、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%AGD的5种试验饲料,5种试验饲料中AGD含量的实测值依次为0.08%、0.23%、0.56%、0.69%和1.09%。摄食生长试验持续56 d。结果表明:随着饲料中AGD添加量的增加,试验鱼的增重、特定生长率以及血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、补体3和补体4含量与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均先增加后降低,0.50%和0.75%AGD组均显著高于对照组(P<0.05)。饲料中添加不同水平的AGD均显著提高了试验鱼血清总抗氧化能力(P<0.05),显著降低了丙二醛含量(P<0.05)。氨氮胁迫96h后,对照组试验鱼大脑中氨和谷氨酰胺含量显著高于各AGD添加组(P<0.05),同时累积死亡率也显著高于各AGD添加组(P<0.05)。由此可见,饲料中添加适宜水平的AGD能够提高黄颡鱼幼鱼的生长性能、抗氧化能力、免疫应答能力及抗逆能力;基于特定生长率的二次回归模型拟合,获得黄颡鱼幼鱼饲料中AGD的最适添加量为0.56%;综合考虑生长性能、抗氧化能力、免疫应答能力及抗逆能力,推荐黄颡鱼幼鱼饲料中AGD的添加量为0.50%~0.75%。 相似文献