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根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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虽然多少次从书本、地图上了解过湖北的湖泊湿地,但当我们3月下旬踏上那片广袤原野,踏上那一片由水衍生、赖水养育且为水所困的土地时,还是被它独特的地形地貌、纵横交错的湿地网络,以及错综复杂的水系所迷惑和震撼,也为它眼下的境遇所深深地困扰着…… 相似文献
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试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。 相似文献
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从含A/duck/FuJian/01/02(W-DKFJ)株病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,用RT-PCR扩增PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS全基因片段,将其分别克隆至PBD载体中.利用8质粒反向遗传操作系统,将重组的PBD质粒共转染293T细胞,成功拯救了该病毒.并命名为R-DKFJ.10(6)EID(50)的W-DKFJ和R-DKFJ分别经鼻腔接种BALB/c小鼠后,观察到两组小鼠体重均明显下降,并且在10d之内全部死亡.与此同时,在感染小鼠后第3天在脑、脾、肾、肺脏等脏器巾分离到病毒,两组小鼠肺脏病毒含量分别为7.4±0.4和7.1±0.1.其MLD(50)分别为O.5log(10)EID(50)/ML和0.98lOg(10)EID/mL.结果表明,救获病毒R-DKFJ与其亲本野生毒W-DKFJ在对哺乳动物模型BALB/c小鼠致病性方面保持着一致的生物学特性. 相似文献
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【目的】 了解目前广东省猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】 运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】 测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1 767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%~99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%~99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株（Viet Nam,登录号：LC602996）、QZ1410株（江苏,登录号：MG732832）、GXBB1501211株（广西,登录号：MH756609）亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有8个氨基酸特异性突变位点,分别是Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G及T216A。抗原指数分析发现,广东省分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第7－12、47－53、80－90、160－170和205－213位氨基酸这5个区域。【结论】 从广东省部分地区分离的4株PCV2均为2d亚型,其Cap蛋白氨基酸序列存在多个突变位点,抗原指数与疫苗株差异较大,提示广东省PCV2的流行趋势逐渐以2d亚型为主。 相似文献
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兽医寄生虫学是动物医学类专业学生的专业必修课程,与兽医临床关系密切,更与人们的生活息息相关。以讲授为主的传统教学模式虽然能够完成教学任务,但已不能适应学科的发展要求。PBL教学法是目前国际上比较流行的一种教学方法。针对兽医寄生虫学教学中存在的问题,在认真总结当前教学模式的基础上,引入了以问题为导向的PBL教学法,得到了大部分学生的普遍认可,收到了良好的教学效果。 相似文献
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A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5).本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了对DKGX的8质粒反向遗传操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了R-DKGX.R-DKGX在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野生毒(W-DKGX,MLD50>106.5)一致的生物学特性,即106EID50鼻腔感染小鼠后3 d均只能在肺脏检测到病毒,病毒含量分别为(3.22±0.51)lgEID50/mL和(3.69±0.88)lgEID50/mL,MLD50>106.5. 相似文献
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为探究1只牦牛屠宰后肝脏有干酪样结节形成的原因,对肝脏进行细菌的分离培养,对分离到的1株细菌的16S rRNA和16S～23S rRNA基因序列用通用引物扩增和并用NCBI blast和MEGA 7进行序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验,结果显示:该菌的16S rRNA为1 524 bp,NCBI GenBank登录号为MG753544.1,与水獭漫游球菌的同源性较高,16S～23S rRNA有大小不同的2个片段,分别为522,425 bp,NCBI GenBank登录号分别为MG758122.1和MG758123.1。Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为迟缓葡萄球菌。该菌对妥布霉素、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感,对苯唑西林、头孢西丁有抗性。结果表明,分离出的细菌为漫游球菌,该菌是否具有致病性还有待进一步试验验证。 相似文献
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为研究猪源性支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的功能及免疫原性,本研究参照GenBank中支气管败血波氏杆菌S798株的外膜蛋白OmpQ基因序列设计引物,通过PCR扩增技术获得OmpQ基因,测序后进行同源性分析,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-OmpQ,转化大肠杆菌Transetta(DE3),经IPTG诱导表达纯化目的蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。结果显示,表达蛋白相对分子质量大小约为36 000,且以包涵体的形式存在。间接ELISA和Western blot结果表明,表达产物具有较好的免疫原性。研究结果为支气管败血波氏杆菌外膜蛋白OmpQ的后续生物学功能研究奠定基础,并为支气管败血波氏杆菌的快速诊断提供数据支持。 相似文献
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为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。 相似文献