农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得     

龚强  王轲  叶兴国  杜丽璞  徐延浩 《中国农业科学》2020,53(18):3638-3649

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。  相似文献   

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析     

章泸尹  郑义盈  王成强  安琪  张萌萌  黄海峰  张振兴  李宝宝  朱姝  杨小健  曹瑞勇  聂鑫  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2019,46(3):661-668

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达，并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列（登录号：CP003313.1）设计1对引物，通过PCR扩增获得目的基因片段，构建pET-28a（+）-recN重组质粒并转化E.coliDH5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明，试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列，通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku，主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析，recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆，消光系数为24 785，不稳定系数为43.99，属于不稳定蛋白；理论等电点（pI）为5.62，为酸性蛋白；总平均亲水性为-0.316，与试验表达的包涵体蛋白性质相同，即同为疏水性蛋白；recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h，在酵母（体内）中的半衰期>20 h，在大肠杆菌（体内）中的半衰期>10 h；二级结构主要以α-螺旋（64.87%）及无规则卷曲（21.00%）为主；经疏水性分析，预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。  相似文献   

流式细胞仪在免疫学研究中的应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

刘涛  张巍  王凤阳  杜丽  成鹰 《动物医学进展》2008,29(3):102-105

随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展,流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域,FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面,尤其是与单克隆抗体技术的结合,使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用,成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。  相似文献   

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析     

章泸尹  郑义盈  王成强  安琪  张萌萌  黄海峰  张振兴  李宝宝  朱姝  杨小健  曹瑞勇  聂鑫  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2019,(3):661-668

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。  相似文献   

转香樟CcCBFs烟草的抗逆性分析     

王建格  周婵  张佳佳  朱逢玲  焦晓琳  杜丽 《园艺学报》2018,45(10):1979-1988

为探究香樟CBF基因（CcCBFa、CcCBFb和CcCBFc）增强植株非生物胁迫抗性的功能,对获得的T1代转基因烟草,分别进行300 mmol · L-1甘露醇模拟干旱、300 mmol · L-1 NaCl溶液模拟高盐和4 ℃模拟低温胁迫处理,测定其丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量,探讨其抗逆性。结果表明：CcCBFb和CcCBFc可显著增强烟草抗旱性;CcCBFa和CcCBFc可显著增强烟草抗盐性;CcCBFc可显著增强烟草抗寒性。CcCBFc可以提高转基因烟草抗旱、抗盐、抗寒能力。  相似文献   

牛乳头瘤病毒的研究进展     

史巧芸  庞峰  杜丽  王凤阳 《中国畜牧兽医》2015,42(6):1613-1619

牛乳头状瘤(bovine papillomatosis,BP)是由牛乳头瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)引起的一种传染性肿瘤病.该病易复发进而癌变,给养殖业等造成严重经济损失.作者主要对BPV的基因型、基因结构及其功能和致病机制方面的研究进展作一综述,为深入研究BPV致癌潜能及抗病毒疫苗的开发提供参考.  相似文献   

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

李治深  杜丽  刘涛  申明霞  王凤阳  成鹰  陈品林  林杰材  满初日嘎  祁超 《安徽农业科学》2009,37(30)

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。  相似文献   

热胁迫下菊花生理变化及其耐热性指标的确定   总被引：6，自引：0，他引：6  

吴友根  林尤奋  李绍鹏  杜丽 《江苏农业学报》2009,25(2)

以神马菊花为试材,研究其在不同时间热胁迫下的热害症状和生理变化.结果表明:①热胁迫抑制了菊花生长发育,随着胁迫时间的延长,叶片热害指数、细胞膜透性和MDA含量持续升高,膜脂过氧化作用加强;总体上叶片中的叶绿素含量和SOD活性呈下降趋势;而根系活力和POD活性在短时间内上升,稍长时间胁迫后则下降,这也表明了菊花生长对热胁迫的响应具有时间的依赖性;②以热害指数为外部直观的鉴定方法可以反映出菊花热胁迫的时间长短,而生理鉴定方法则以叶绿素和MDA含量为最佳指标.  相似文献   

山西省吕梁市离石区水库移民安置问题及对策     

杜丽 《北京农业》2011,(3):196-197

水库移民问题是一个复杂的社会经济问题。笔者阐述了当前山西省吕梁市离石区水库移民再生产生活中存在的问题,深刻分析了问题产生的原因,并提出了解决问题的措施。  相似文献   

大白菜“早熟5号”不定芽再生体系的优化     

史超  王银娟  杜丽  阚云超  高向阳 《江苏农业科学》2011,39(5)

选用大白菜品种“早熟5号”为材料,分析了外植体、苗龄、AgN03和植物激素对其不定芽再生的影响.结果表明:不同外植体类型中,采用4～5d苗龄的带柄子叶为外植体再生频率最高,添加AgN03后在3～7 mg/L的浓度范围内外植体分化率大幅度提升,分化率最高达到78.33％,带柄子叶于MS+6- BA 5 mg/L+ NAA 1 mg/L+ AgNO33 mg/L培养基上不定芽分化率最高,达到86.41％.  相似文献