黄瓜中导入野生酸黄瓜外源DNA片段的分子验证     

史建磊  陈劲枫  娄群峰  隋益虎  吴志明  张淑霞 《中国农业科学》2010,43(22):4663-4670

【目的】对栽培黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=14)与野生酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.,2n=24)经远缘杂交和多代回交、自交而来的渐渗系进行分子标记分析和表型鉴定,旨在为黄瓜导入酸黄瓜外源DNA片段提供相应依据。【方法】从分子标记分析、DNA序列比对和农艺性状表现上对各渐渗系和双亲进行研究。【结果】渐渗系与栽培黄瓜存在13.2%的遗传多态性,包括供体特异带、缺失带和产生的新带。利用RAPD引物D-11和SSR引物06632在渐渗系中分别扩增出约310bp和150bp的酸黄瓜特异带,序列分析表明其与酸黄瓜相应DNA片段的相似性分别为92.93%和96.48%,碱基差异分别为41个和9个,包括碱基转换、颠换和缺失。表型鉴定发现其呈现出酸黄瓜的遗传特性。【结论】野生酸黄瓜DNA已渐渗进入栽培黄瓜基因组,同时发生了少量不同类型的变异。  相似文献   

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用     

赵雪丽  闫若潜  吴志明  曹伟伟  王淑娟  谢彩华  马震原  周兵强  王东方 《中国畜牧兽医》2015,42(4):865-870

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义.  相似文献   

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究   总被引：1，自引：1，他引：0  

马文涛  闫若潜  吴志明  刘光辉  盛敏  谢彩华 《中国畜牧兽医》2011,38(11):102-105

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。  相似文献   

猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

闫若潜  赵明军  张志凌  张健  盛敏  刘光辉  吴志明 《农业生物技术学报》2008,16(1):55-60

摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体（M.suis）推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒（pGEX-T/M.suis）为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）;对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示：标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。  相似文献   

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果   总被引：2，自引：2，他引：0  

贾松涛  闫若潜  崔保安  吴志明  张志凌  张健  赵雪丽 《农业生物技术学报》2008,16(5)

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2.  相似文献   

猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

拜廷阳  杨增岐  吴志明 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2008,36(1):7-12

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。  相似文献   

生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌3种检测方法的比对     

陆东锋  李金磊  高延玲  方忠意  董鹏  狄元冉  李红婵  吴志明 《中国动物检疫》2020,37(2):94-98

为确定生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌的快速检测方法,以从河南省奶站及奶牛养殖场抽取的267批生鲜乳为检测对象,分别采用传统培养法、PCR检测法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法进行检测,并以传统培养法为参考标准,对检测结果进行比对确认。结果显示:常规的传统培养法检出阳性3份;PCR法检出阳性5份,经传统培养法确认阳性3份,符合率为60%;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检出阳性3份,经传统培养法全部确认为阳性,符合率为100%。结果表明,同传统培养法相比,PCR法容易产生假阳性结果,而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法能够快速、准确检测生鲜乳中单核细胞增生李斯特菌,适合于大批量样品的快速检测。  相似文献   

日本三桠引种育苗试验     

吴秀山  吴志明 《安徽林业科技》1994,(1):39-40

  相似文献   

猪瘟脾淋苗临床应用效果评估分析     

郭小玲  吴志明  闫若潜  赵雪丽  盛敏  陈涛 《黑龙江畜牧兽医》2013,(1):133-135

猪瘟是猪的一种高度接触性、传染性、病毒性疾病,世界动物卫生组织将此病列为A类传染病,我国将其列为一类动物疫病,是危害我国养猪业发展的主要传染病之一,给养猪生产造成了严重的经济损失。各年龄阶段和不同品种的猪对该病均易感。  相似文献   

三氮脒在羊体内的消除规律研究     

江迪  吴志明  吴宁鹏 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2020,48(3):47-53

【目的】研究三氮脒在羊体内的消除规律,为保障动物源食品安全提供理论依据。【方法】分别配制质量浓度为0.05,0.1,0.2,0.5,1,2和5μg/mL的三氮脒标准液,进行高效液相色谱分析,建立三氮脒标准曲线。采集空白羊肌肉、肝脏、肾脏的组织样品,进行三氮脒加标试验,测定批内平均回收率和批内、批间相对标准偏差,建立羊组织中三氮脒残留的高效液相色谱检测方法。选取35只健康湖羊,逐只按5 mg/kg的剂量颈部肌内注射三氮脒3次,每次间隔24 h,在最后一次给药后0.25(6 h),1,3,7,14,21,28 d,分别采集肌肉、肝脏、肾脏和注射部位等组织,采用高效液相色谱法测定各组织中三氮脒的残留量,并用WinNonlin5.2.1软件计算药物消除动力学参数。【结果】在质量浓度为0.05～5μg/mL时,三氮脒质量浓度与峰面积线性关系良好,相关系数(r)为0.999 5;三氮脒高效液相色谱法对羊肌肉的检测限为50μg/kg,定量限为100μg/kg;对羊肝脏、肾脏的检测限为200μg/kg,定量限为500μg/kg;批内平均回收率为83.1%～94.8%,批内相对标准偏差为2.6%～6.2%,批间相对标准偏差为3.0%～4.9%。在给药后6 h,供试湖羊肌肉、肝脏、肾脏和注射部位三氮脒残留量达到最高值,随后在各个检测时点各组织残留量均呈下降趋势;在给药后21 d,肌肉组织中未检出三氮脒残留,肾脏组织和注射部位(定量限同肌肉)中三氮脒的平均残留量降至定量限以下,肝脏中三氮脒的平均残留量也明显降低;给药后28 d,羊各组织均未检出三氮脒残留。三氮脒在羊肌肉、注射部位、肾脏和肝脏组织中的消除半衰期(T_(1/2β))分别为104.21,99.55,102.66和149.42 h,药时曲线下面积(AUC)分别为113.20,349.33,3 658.62和3 370.83 (h·μg)/g,消除速率(β)分别为0.006 6,0.007 0,0.006 7和0.004 6 h~(-1),平均滞留时间(MRT)分别为125.11,140.62,71.20和154.71 h。【结论】三氮脒经肌内注射给药后,在羊体内分布广泛、消除缓慢,在肝脏和肾脏组织中残留量较高。  相似文献