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【目的】以羊口疮病毒129(ORFV129)蛋白为研究对象,在构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库的基础上,通过酵母双杂交筛选与其相互作用的蛋白。【方法】采用SmartTM技术构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pGBKT7-129,并将其转化至Y2HGold酵母感受态细胞,验证质粒pGBKT7-129是否具有自激活性。对转化了质粒pGBKT7-129的菌液进行生长曲线测定,验证该质粒是否对酵母细胞有毒性作用。以ORFV129为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选出与ORFV129相互作用的宿主胞内蛋白并对阳性菌落进行PCR和测序鉴定。利用DAVID 6.7的GO数据库对胞内宿主蛋白进行功能分类和通路分析,并依据Cytoscape v 3.8.0软件绘制ORFV129与胞内蛋白相互作用的网络图。以山羊脾脏为组织样本,采用RT-PCR技术克隆山羊补体C1q结合蛋白(complement C1q binding protein,C1QBP)基因CDS区序列,并采用在线软件进行生物信息学分析。将C1QBP基因CDS区序列连接至pcDNA3.1(+)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-C1QBP,并将其转染至山羊鼻甲骨原代细胞进行亚细胞定位分析。【结果】试验成功构建山羊鼻甲骨原代细胞cDNA文库,文库容量约为6.0×106 CFU/mL。成功构建诱饵质粒pGBKT7-129,重组质粒pGBKT7-129无自激活能力且对酵母细胞无毒性。利用酵母双杂交筛选出14个与ORFV129进行互作的胞内蛋白并对阳性克隆进行PCR、测序验证。试验成功克隆山羊C1QBP基因CDS区,长度为837 bp,编码279个氨基酸。系统进化树显示,山羊和绵羊亲缘关系最近。C1QBP蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽结构和跨膜结构域,主要包括3种磷酸化位点,分别是18个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸位点。C1QBP蛋白二级结构由α-螺旋(33.81%)、无规则卷曲(46.40%)、延伸链(16.91%)和β-转角(2.88%)组成,三级结构与二级结构一致。间接免疫荧光试验表明,C1QBP蛋白散在分布于细胞质中。【结论】筛选出了与ORFV129蛋白相互作用且在天然免疫应答中发挥作用的宿主胞内蛋白C1QBP,通过间接免疫荧光试验验证C1QBP定位于细胞质中,推测ORFV129与能C1QBP相互作用诱导炎症,为进一步验证ORFV129蛋白介导ORFV抑制机体免疫应答的过程奠定基础。 相似文献
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沙门菌(Salmonella)是一类条件性细胞内寄生肠杆菌,多数能引起宿主胃肠炎或败血症,也是食物中毒主要病原菌.由于其血清型复杂,在畜牧生产上,常使用抗菌药物防治该病发生.随着药物的广泛使用,耐药性问题日趋严重.据有关耐药性监测数据表明,整个沙门菌属的多重耐药率从上世纪90年代20%~30%增加到本世纪初70%,耐药菌的大量出现,已成为全球关注的公共卫生问题[1].本试验采集我国不同地区病鸡样本,分离鉴定出210株沙门菌,对21种抗菌药物进行了敏感性检测,为我国动物源微生物耐药性监测体系的建立提供数据. 相似文献
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同时采用间接ELISA、虎红平板凝集试验和试管凝集试验三种血清学方法调查川西北牦牛布鲁氏菌病血清流行情况。对1070份采自川西北阿坝州8个草地县的牦牛血清样品经三种血清学方法检测,间接ELISA检测阳性率为25.4%(272/1070),虎红平板凝集试验检测阳性率为12.7%(136/1070),而试管凝集试验检测阳性率为9.1%(97/1070)。8个县均发现阳性布鲁氏菌病血清。与间接ELISA相比,虎红平板凝集试验的相对敏感性和特异性分别为50%和100%,而试管凝集试验的相对敏感性和特异性分别为35.7%和100%。布鲁氏菌病在川西北地区广泛存在,血清学方法是检测和监测布鲁氏菌病最常用和最简便的方法,其中间接ELISA方法最为敏感。 相似文献
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在病毒学研究中,对体内外病毒载量及细胞基因表达水平进行定量分析,对于从分子水平上揭示病毒的致病机理、病毒和机体之间的相互作用等十分必要[1].在众多对核酸定量的方法中,实时荧光定量PCR,简称Real-time PCR或Kinetic PCR,是20世纪90年代发展起来的一项新技术,由于其与常规PCR相比,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、无需PCR后电泳、全封闭反应等优点,在多个学科领域中都得到了应用.文章就Real-timePCR技术在病毒学研究中的应用进行了简要概述. 相似文献
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为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 相似文献
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鸭致病性大肠杆菌外膜蛋白型研究 总被引:3,自引:0,他引:3
测定了从我国分离到的130株鸭病原性大肠杆菌外膜蛋白型(Outer membrane protein patterns,OMP型),其中O93、O92、O78和O76优势血清型53株,O46等30个其他血清型分离株77株,这些分离株共产生了4个OMP型,其中OMP-1型81株,占62.3%(81/130),覆盖O93、O92、O78和O76等29个血清型,占85.3%(29/34),为主要的OMP型;根据GenBank中大肠杆菌K-12外膜蛋白A基因(ompA)的核苷酸序列设计引物,从9株优势血清型和1株O46血清型的鸭大肠杆菌中分别扩增得到ompA基因,进行序列测定及分析,发现优势血清型9个菌株的ompA均由1 171个碱基组成,均只有1个大的开放阅读框(ORF),长1 053 bp,编码由350个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro-OmpA),前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由329个氨基酸残基组成;O46菌株的ORF全长1 041 bp,在400-411 bp位缺失了12个碱基,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成;10个鸭致病性E.coli的ompA基因核苷酸序列高度同源,相似性达95.8%~100%。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株的仔猪回归试验及病毒在体内的分布研究 总被引:7,自引:0,他引:7
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种新的传染性疾病。该病自发现以来已经给各主要养猪国家带来了巨大的经济损列。1998年我们从重庆地区发病猪场的母猪血清中分离到PRRSV—SCQ毒株,经鉴定属美洲型毒株。因为用分离株进行病理机制研究方面的报道则更少。本试验以PRRSV重庆分离株人工感染易感仔猪,以复制出PRRS病症,研究病理变化特征和确定病毒抗原在仔猪体内的定植情况,为临床诊断和有效预防该病提供理论参考,也为进一步确证分离到的SCQ毒株属PRRSV提供佐证。 相似文献